原子荧光法测定受诸多因素影响,条件控制要求比较严格。尤其在应用原子荧光测汞时,实验的各环节诸如实验氛围,仪器设置,都会影响空白值,最终影响测量结果的准确性和可靠性。
外部环境及原子荧光光谱仪仪器设置因素对测定的影响及解决办法如下:
1 温度湿度影响
温度、湿度是影响氢化反应的重要因素。温度过高、过低,都会使测定稳定性变差,湿度过大,会引起散射干扰造成荧光猝灭导致荧光信号降低。实践证明,湿度对汞空白有较显著影响。
解决办法:严格控制仪器室内温度在15~30℃,湿度不大于75%。
2 炉高选择
原子荧光测定灵敏度随观测高度的变化而变化。高度太低时(小于7.5mm),石英炉的散射光将造成很高的背景读数,对空白影响较大,过高时也会导致灵敏度及测量精度的下降。根据原子荧光光谱仪实际工作情况,通过条件试验确定最佳炉高,同等条件下炉高对空白影响见下表。
解决办法:测汞时,内干扰较大,通常通过降低炉高,使用氩氢火焰外焰测汞,可有效降低汞空白,由表2可知,AFS930测汞时10mm炉高为较佳选择。
3 光漂因素
光漂即由于光源因素引起的检测值的漂移。尤其汞灯,随环境温度的变化检测值变化较大。
解决办法:①充分预热仪器与汞灯30min~1h,采用大电流预热(40mA),低电流检测(25mA或30mA),可有效降低漂移现象。②检查光路是否发生移位,正确调整好光路后,可使汞灯往后移2~5mm,可降低空白值高的现象。③实验室环境,排气扇(空调)的高度、功率过大时,荧光信号影响较明显,可做适当调整。④实际测量中,样品较多时,每隔二三十样品,重测空白和工作曲线的某单点浓度,来重新拟合标准曲线,降低由于光源的漂移而造成的空白值和样品含量增大。
流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的?FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度, FL2-H是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用,用于去除粘连细胞。
2、流式同型对照怎样选择?
同型对照(Isotype Control):使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白,用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗,可以用an normal serum(与一抗相同的正常血清) (must be the same species as primary antibody)。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同,应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。举个例子:比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b,clone OX-42 purified IgG,那么它的isotype 是mouse IgG2a, 所以可以用purified(纯化的) mouse IgG2a来做OX-42的同型对照(Isotype Control)。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。
同型对照:是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类,若使用直接免疫荧光染色法,同型对照也应标记荧光色素,如IgG1 FITC、IgG2a、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外,同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F:P比值(标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值)应该相同为zui佳,这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义,切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照,zui好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备
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