7 基因工程载体

文章题目： Programme of self-reactive innate-like T cell-mediated cancer immunity

发表时间及期刊：2022年4月20日 发表在 Nature 期刊

影响因子： 2020/2021: 49962

主要内容： 在小鼠乳癌模型（PyMT）发现一种新型细胞 先天性杀伤型 T 细胞 （Killer Innate-like T cell， ILTCK）。

这类细胞的特点：

1 和传统 CD8 T 细胞一样都表达 T 细胞受 体 （T cell receptor，TCR），但其激活不依赖树突细胞（Dendritic Cell，DC），此特性使其更接近先天性淋巴细胞（Innate lymphoid cell）。

2 不同于传统 CD8 T 细胞，ILTCK 不表达 PD-1 和其他免疫抑制受体，因此不会进入细胞耗竭状态，反而对肿瘤细胞有更强大的细胞毒性（cytotoxicity）。

3 大部分的传统 T 细胞识别肿瘤新抗原，而 ILTCK 识别肿瘤 原生抗原 ，并且具有显著的组织驻留性（tissue residency）。

研究结果：

1 ILTCKs有一个独特的转录组

为了研究肿瘤浸润性T细胞之间的异质性，我们对来自MMTV-PyMT(PyMT)小鼠乳腺肿瘤组织的CD45+TCRβ+CD8α+细胞进行了单细胞rna测序(scRNA-seq)分析，得到5个不同的簇。主要的marker基因如下：

进一步的进行轨迹推断，我们观察到初始/最近激活的(C1)细胞和耗尽的(C2)细胞之间的大量混合(图1d，e)，反映了由慢性刺激驱动的表型变化。相比之下，αβILTCKs（C3）和增殖（C5）细胞与C1分离的距离更远（图1d，e）。在校正了“细胞周期效应”后，最近激活向αβILTCK过渡的假设轨迹仍然与最近激活到耗尽的T细胞分化途径不同(扩展数据图2a，b)。因此， C1细胞要么通过一种独特的分化途径产生C3细胞，要么不是它们的祖细胞。 高表达αβILTCK基因特征的肿瘤浸润性c3样CD8α+T细胞簇在PyMT乳腺肿瘤和小鼠前列腺癌模型(扩展数据图2c-h)以及人类结直肠癌4(扩展数据图2i-k)中重复存在， 共同表明αβILTCK分化程序代表了一种进化上保守的肿瘤引起的免疫反应。

2 ILTCKtcr可以识别未突变的肿瘤抗原

为了探究肿瘤驻留的NK11+CD8α+αβILTCKs与传统的PD-1+CD8α+T细胞(PD-1+T细胞)有何不同，我们获得了每个子集使用的配对tcr序列的图谱(扩展数据图3a，补充表1)。然而，来自NK11+αβILTCKs和PD-1+T细胞的TCR之间的互补决定区3(CDR3)长度相似(扩展数据图3b)。值得注意的是，我们没有检测到NK11+αβILTCKs和PD-1+T细胞所使用的任何TCR对， 这表明它们不是由一个共同的祖细胞发展而来的。

为了确定每个亚群的TCR的特异性，我们使用改进的TCR报告检测系统对它们对原发性PyMT癌细胞进行了反应分析(图2b，扩展数据图3c，补充表2)。33个NK11+αβILTCK衍生的tcr中有26个（788%）对异源癌细胞表现出显著的反应性(图2c) 怎么得到的表 ，表明它们识别来自多个小鼠的癌细胞共享的未突变抗原。相比之下，没有一种PD-1+T细胞来源的TCR的反应超过了无关的OT-ITCR建立的背景水平(图2c)， 这意味着它们对个体肿瘤特异性新抗原有反应。

当癌细胞缺乏经典的主要组织相容性复合体I类(MHC-I)编码基因 （H2-K1和H2-D1） 或所有MHC-I分子的 专性亚基B2m 时，这种反应性丧失。 这表明αβILTCKtcr与它们的CD8+T细胞一样，主要局限于经典的MHC-I。

为了测试αβILTCKTCR是否识别MHC-I分子，而不管肽序列，我们使用PyMT肿瘤来源的癌细胞系缺乏内质网肽转运体TAP1，因此具有几乎无法检测到的表面MHC-I水平(扩展数据图4f)。Siinfekl肽稳定的MHC-I表达不足以激活αβILTCKTCRs(扩展数据图4g，h)， 表明这些TCRs识别特定的肽-MHC-I复合物，而不是MHC-I分子本身。

3 ILTCKs are agonistically selected

为了研究传统的CD8+T细胞是否会产生NK11+αβILTCKs，我们在CD8+T细胞中将内源性重排的TCR替换为αβILTCK衍生的TCR(扩展数据图5a-e)。在过继转移到携带肿瘤的受体小鼠中(图2d)后，表达αβILTCK衍生TCR的CD8+T细胞显示PD-1表达上调，而NK11表达不上调(图2e，f，扩展数据图5f)。此外，传统的CD8+T细胞反应需要BATF3-和irf8依赖的传统1型树突状细胞(cDC1s)启动，而肿瘤内NK11+αβILTCK反应独立于cDC1s（扩展数据图6）。 这些发现表明，αβILTCKs独立于次级淋巴器官中树突状细胞介导的启动，并具有与传统CD8+T细胞不同的本体论。事实上，在肿瘤中，表达αβILTCK衍生TCRs的胸腺细胞发育中，持续且特异性地产生NK11+αβILTCKs，而不是PD-1+T细胞 (图2g-i，扩展数据图7a-c)。因此，NK11+αβILTCK和PD-1+T细胞代表了两种相互排斥的细胞命运选择，在胸腺细胞发育过程中，任何一种细胞系都可能以tcr特异性依赖的方式发生。

而具有多克隆TCR库的胸腺细胞主要产生常规的CD4或CD8单阳性T细胞(图3a，b)，而含有单克隆αβILTCKTCR的胸腺细胞 只产生CD4-/loCD8-/lo细胞 (图3a，b，扩展数据图7d，e)。到目前为止，所有已知的TCRαβ+T细胞在发育过程中都在胸腺中经历了CD4+CD8+双阳性阶段。与预期的一样，肿瘤驻留的NK11+αβILTCKs和PD-1+T细胞，而不是CD19+B细胞，被Rorc-cre等位基因一致定位，该等位基因在CD4+CD8+胸腺细胞中瞬时活跃(扩展数据图7f，g)。然而，与其他先天T细胞，如不变的自然杀手T(iNKT)细胞，由高表达的转录因子Zbtb，NK11+ αβILTCKs 没有命运映射Zbtb16-cre-Rosa26LSL-YFP等位基因(扩展数据图7h，我)，可能由于缺乏经典的MHC-I表达CD4+CD8+胸腺细胞。

经阳性选择后，CD4+CD8+胸腺细胞瞬时表达低水平的PD-1。相比之下，表达αβILTCK-TCR的胸腺细胞保持了较高的PD-1表达(扩展数据图7j，k)，表明其有强烈的TCR刺激的历史。事实上，33个αβILTCK衍生的TCR中有23个（697%）对胸腺上皮细胞皮系表现出大量的反应性，其水平超过OT-ITCR，驱动了传统CD8+T细胞的阳性选择(扩展数据图7l，数据未显示)。这些发现表明， 强烈的自身反应性驱动αβILTCK谱系承诺，类似于指定iNKT细胞和肠道上皮内淋巴细胞(IEL)命运的“激动剂”选择过程。

为了区分造血间质和耐辐射基质间在介导αβILTCK选择中的作用，我们以野生型或B2m-/-小鼠为受体，生成了TCR-“逆转录”小鼠。B2m-/-受体的胸腺αβILTCK祖细胞室未改变（扩展数据图7m），但仅在造血室B2m消融轻度减少，B2m消融显著减少（扩展数据图7n）。因此，αβILTCKs的激动剂选择信号由辐射敏感的造血和抗辐射的间质室冗余提供。

4 ILTCKs continually repopulate tumours

不断地再生肿瘤

大量携带αβILTCK-tcr的胸腺细胞共同表达PD-1和CD122(扩展数据图7j，k)，这一表型让人联想到IEL承诺的胸腺祖细胞。事实上，表达αβILTCK肿瘤tcr的胸腺细胞除了瘤内αβILTCKs外，还分化为小肠IELs，两个群体都表达CD8αα同型二聚体(扩展数据图8a-c)。在过继转移到淋巴细胞减少的肿瘤小鼠，多克隆TCRβ+CD4-/loCD8-/loPD-1+CD122+胸腺祖细胞既产生瘤内αβILTCKs，也产生肠道IELs(图3c，d，扩展数据图8d，e)。然而，在淋巴细胞丰富的小鼠中，αβILTCK和IEL祖细胞移植到肿瘤中，而不是在小肠中(图3c，d)。为了进一步探索肿瘤内αβILTCK和肠道IEL再生的动态，我们使用了Fgd5-creER-Rosa26LSL-tdTomato等位基因，其中他莫昔芬脉冲标记了部分造血干细胞26，能够稳定跟踪其后代(扩展数据图8f)。在Lin−-KIT+SCA1+骨髓干细胞中，有20%的标记效率，大约3%的胸腺αβILTCK/IEL祖细胞被命运定位，类似于成年小鼠的CD4+CD8+、CD4或CD8单阳性和iNKT细胞室(扩展数据图8g-i)。相比之下，小肠CD8αα+IELs的标记能力可以忽略不计(扩展数据图8k，l)，证实了早期播种和原位增殖是其种群维持的主要手段27。因此，肿瘤内αβILTCK室，而不是肠道IEL室，不断由胸腺祖细胞补充。

5 FCER1G的表达标志着ILTCK谱系

为了深入了解ILTCK谱系的特征，我们将肿瘤浸润性NK11+αβILTCKs和PD-1+T细胞与其各自的胸腺祖细胞进行了比较(扩展数据图9a)。在αβILTCK祖细胞中上调但在成熟祖细胞中被抑制的基因在与抗原刺激相关的基因中富集，包括Tox-Pdcd1程序(扩展数据图9b，补充表3)，反映了激动剂选择事件。αβILTCK祖细胞中Lat和Cd2的下调可能会抑制TCR信号传导，使成熟的αβILTCKs不容易被耗尽(扩展数据图9c，补充表3)。值得注意的是，编码许多NK受体和信号分子的基因在αβILTCK祖细胞中表达上调(扩展数据图9d，补充表3)，并在成熟的NK11+αβILTCKs8中保持高表达。相比之下，与末端效应分化和组织驻留计划相关的途径，包括Gzmc、Itga1和Itgae，可能是通过响应局部肿瘤微环境特异性信号而获得的(扩展数据图9e，补充表3)。

虽然承诺的αβILTCK祖细胞的过继转移持续产生NK11+αβILTCKs，但仍有相当一部分是NK11−细胞(图3c)。这不太可能是αβILTCK祖细胞之间预先存在的TCR异质性的结果，因为表达单克隆TCR的胸腺细胞也产生了NK11−和NK11+亚群(图2g-i，扩展数据图7b，c)。与PD-1+T细胞相比，NK11-细胞在转录上更类似于NK11+αβILTCKs(扩展数据图9f)，但它们在胸腺αβILTCK祖细胞中富集的转录本表达更高，包括Pdcd1（补充表4）。与终末效应分化相关的基因，包括Gzmc，在获得NK11时共同上调（补充表4）。因此，NK11标记激活了αβILTCKs，可能不能识别肿瘤中所有的αβILTCK细胞谱系。

scRNA-seq实验显示，在小鼠的癌症模型中，Fcer1g在转录定义的αβILTCK簇(C3)中存在差异表达(扩展数据图。1,9g，h)，并标记了一个在结肠直肠癌患者的肿瘤组织中与小鼠αβILTCKs转录相似的C3亚群(扩展数据图。2i–k, 9i)这些观察结果表明，Fcer1g可能是一个保守的αβILTCK谱系定义标记。事实上，FCER1G蛋白已经上调承诺PD-1hiCD122hi胸腺αβILTCK祖细胞，但不是在CD8单阳性细胞，并继续表达肿瘤浸润NK11+αβILTCKs而不是PD-1+T细胞(扩展数据图9j，k)，表明FCER1G具体和稳定标记细胞致力于αβILTCK血统。

在CD4−CD8α−TCRβ+CD1d−NK11−胸腺细胞中，FCER1G+CD122+群体表达高水平的PD-1，缺乏颗粒酶B(GZMB)表达，表型与CD122和PD-1共同表达的αβILTCK和IEL祖细胞相同(图4a，b)。在肿瘤浸润性T细胞中，FCER1G+CD122+群体仍然是CD4−，其中大多数上调CD8αα同型二聚体(扩展数据图9l，m)，并且一致缺乏PD-1的表达(图4a，b)。值得注意的是，FCER1G+CD122+T细胞中同时含有NK11+GZMB+/−αβILTCKs和它们未成熟的NK11−GZMB−前体(图4a，b)。因此，FCER1G的表达可以充分识别肿瘤浸润性αβILTCKs，而不管其激活状态如何。

在结肠癌患者中，FCER1G+TCRβ+细胞也很容易在肿瘤组织中检测到(扩展数据图9n)，其共受体表达谱与小鼠相似(扩展数据图9n，o)。FCER1G+T细胞相对于邻近的正常结肠在肿瘤组织中富集(图4c，d)，与PD-1+相比，它们表达了更高水平的GZMB(图4e)。总的来说，这些发现确定了FCER1G作为αβILTCK谱系定义标记，并证明αβILTCK程序在小鼠和人类中代表了一种进化上保守的肿瘤引起的免疫反应。

6ILTCK可被设计用于癌症治疗

与之前的研究表明NK11+αβILTCKs严重依赖于促炎细胞因子IL-15相一致，我们在缺乏Il15的小鼠中观察到FCER1G+CD122+胸腺αβILTCK祖细胞几乎完全缺失(图5a，b)。因为IL-15在两者中都有表达淋巴组织和非淋巴组织，驱动肿瘤内αβILTCKs的扩张和激活的IL-15的确切来源尚不清楚。在造血细胞系中消融Il15并没有损害肿瘤引起的αβILTCK反应（数据未显示）。值得注意的是，与健康的乳腺组织相比，转化的乳腺上皮细胞中IL-15的表达明显增加(图5c)。IL-15在结肠癌患者的肿瘤上皮细胞中也很容易被检测到(扩展数据图10a)，而FCER1G+的频率，而不是PD-1+，T细胞与IL-15水平呈正相关(图5d，扩展数据图10a，b)。

为了研究癌细胞表达的IL-15是否调节αβILTCK反应，我们使用了S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠，这些小鼠中Il15在转化中缺失，但在健康的乳腺上皮中没有缺失(扩展数据图10c，数据未显示)。S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠的胸腺FCER1G+CD122+αβILTCK祖细胞水平相似(图5e，f)。值得注意的是，与对照组相比，S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠中肿瘤浸润性αβILTCKs明显减少，而残留的αβILTCKs中NK11和GZMB的表达明显减少(图5e，f)。值得注意的是，与野生型对照组相比，S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠表现出加速的肿瘤生长(图5g)。这些发现表明，ILTCKs可以感知癌细胞来源的IL-15，用于癌症免疫监测。

值得注意的是，IL-15足以在胸腺αβILTCK祖细胞中诱导NK11和GZMB的上调，以及伴随的PD-1的下调(扩展数据图10d)。为了测试异位激活IL-15信号是否在过继转移的αβILTCK祖细胞可以抑制肿瘤的发展，我们从Ubc-creER-Rosa26LSL-Stat5b-CA/+小鼠中纯化胸腺αβILTCK祖细胞，其中他莫昔芬诱导转录因子STAT5B(STAT5B-CA)的表达，主要协调IL-15信号下游的转录程序31(扩展数据图10e)。在过继转移到淋巴细胞缺陷的肿瘤携带PyMT小鼠后，STAT5B-CA的诱导表达导致转移细胞扩增60倍，四周内NK11和GZMB均匀上调(扩展数据图10f-i)。重要的是，与对照组αβILTCKs或无细胞转移的小鼠相比，接受STAT5B-ca武装αβILTCKs的小鼠表现出明显的肿瘤生长抑制作用(扩展数据图10j)。

当过继转移到充满淋巴细胞的PyMT宿主时，STAT5B-ca武装的αβILTCK祖细胞很容易定植肿瘤组织，并经历了强大的扩增和效应分化，导致肿瘤生长减少(图5h-j，扩展数据图10k)。相比之下，过继转移的STAT5B-ca武装的胸腺CD8单阳性T细胞没有移植或分化，可能是由于肿瘤反应性克隆的频率较低，并且预期肿瘤生长没有改变(图5h-j)。因此，αβILTCK中的IL-15信号轴可以成为开发癌症治疗方法的一个强大的和可利用的底物。

Discussion

在这项研究中，我们建立了FCER1G+αβILTCK程序，作为一种独特的和进化保守的肿瘤诱导的T细胞反应，并确定癌细胞来源的IL-15是其抗肿瘤作用的必要和充分驱动因素。由于FCER1G为多个NK受体提供了必要的激活基序，其在胸腺αβILTCK祖细胞中的早期表达可能增强其在肿瘤组织中NK受体上调时效应功能的快速获得。虽然FCER1G也特异性地标记了人类肿瘤浸润性αβILTCK样细胞的一个亚群，但在部分循环的人CD8+T细胞中，延长IL-15暴露可以诱导FCER1G32。可以想象，FCER1G的表达在人类αβILTCKs中可能比在小鼠αβILTCKs中更动态地调控。另外，FCER1G可能标记除人类αβILTCK之外的其他谱系，其解决方案需要进一步的研究。尽管广泛表达肿瘤反应性tcr，但il-15激活的αβILTCKs8的细胞毒性是不可必要的。

1桃表面光滑由显性基因控制，有毛由显性基因控制，现对雌毛桃（bb）授予光桃（Bb）的花粉，该雌桃发育成的果实应为表面（ ）

桃子的果皮是由子房壁发育来的，种子是由受精卵发育来的。现在用的是毛桃（bb）做为母本，光桃（Bb）做为父本，其种子的基因型是（Bb）或者（bb），由于基因分离定律两者比例为1：1。而子房壁的基因型仍旧是母本的（bb）所以生长出来的子1代果实的表面仍旧是毛桃。当你把子1代的种子种植后，授粉发育后，从理论上来讲有50%的果实会是光桃，也就是植株基因型为（Bb)

2蜜蜂的体色，褐色相对黑色为显性，控制这一相对性状的基因位于常染色体上，现有褐色雄蜂和黑色蜂王杂交，则F1的体色是？如果后代中有工蜂，那么工蜂的体色呢？

首先要说明，雄蜂是由蜂王（雌蜂）的未受精卵细胞发育来的。是单倍体。

设显性基因为A，隐性为a 黑色蜂王基因型：aa 褐色雄蜂基因型：A

F1基因型：a（雄蜂）或Aa（雌蜂/蜂王） 因此，后代中，褐色为雌蜂，黑色为雄蜂

工蜂由受精卵发育而成的雌蜂。但它的生殖器官发育不完全。

3一株纯黄粒玉米与一株纯白粒玉米相互授粉，比较这两个植株结出的种子的胚和胚乳的基因型，结果是：

A、胚的基因型不同，胚乳的基因型相同 B、胚的基因型相同，胚乳的基因型不同

C、胚的基因型和胚乳的基因型都相同 D、胚的基因型和胚乳的基因型都不同

将基因型为Aabb的玉米花粉给基因型为aaBb的玉米授粉，所得到的籽粒，其种皮、胚、胚乳的基因型种类依次为：

A、1、2、3 B、1、2、4 C、1、4、4 D、1、4、6

第一题：B

原因：两植株相互受粉，子代所的遗传物质相同，即合子是相同的，胚的基因型只与合子的基因相关，而胚乳的基因型是与母本的基因相关，子代的母本不一样，自然胚乳的基因型不同。

第二题：C

种皮：与母本相同，为aaBb；

胚：AaBb,Aabb,aaBb,aabb四种；

胚乳：AaaBBb,Aaabbb,aaaBBb,aaabbb四种。

第一题未确定母本与父本，而第二题已确定了父本与母本。

胚是由一个父本配子+一个母本配子； 胚乳是一个父本配子+两个母本配子。

4人的黑发对金**发为显性，一对夫妇全为杂合体黑发，他们的两个孩子中，一个为黑发，另一个为金**发的概率为多少？（需要过程）

设为A(显性)对a（隐性）

夫妇都是Aa

一个黑发 可能是AA(1/4)Aa(1/2) 一个金发aa（1/4）

先有一个黑发 再有一个金发就是（1/4+1/2）（1/4）=3/16

最后别忘了 排列组合中的一个要点 就是我们在排列的时候包含了顺序 所以应该再乘以2 得3/8

另：假设夫妇的基因型为Aa,Aa（由题目杂合黑发知）

一个黑发A＿概率为：3／4（1-1／21／2） 一个金黄发aa概率为：1／4（1／21／2）

结果为3／41／4＝3／16

例如：基因型为AaBbCc的个体产生的配子类型推算方法是：将A、a分写为两行，然后再将B、b分别写在Aa后面各成两行。这时共有四行。再将C、c。分别写在B、b后面各成两行，共有八行。这时就可以清楚地看到配子中含有非同源染色体的八种类型（图5－1）了。

如：1基因型为DdTt的个体自交，产生的后代中ddTT和ddTt的个体分别占整个子代个体的比例为 和 。

解：DdTt DdTt 先对一对相对性状考虑，Dd和Dd 杂交得dd的比例为1/4；Tt和Tt杂交得TT的比例为1/4，Tt为1/2；综合两对相对性状，则ddTT和ddTt在后代中的比例分别为1/41/4=1/16和1/41/2=1/8。

(例1)一个基因型为YyRr的精原细胞和一个同样基因型的卵原细胞，按自由组合规律遗传，各能产生几种类型的精子和卵细胞 ( )

A、2种和1种 B．4种和4种 C．4种和1种 D．2种和2种

剖析：此题考查的是减数分裂和基因自由组合规律的知识。考生易误选B和C项，原因是忽略了“一个”二字。实际上一个精原细胞，在减数第一次分裂的后期非等位基因自由组合时，只能是两种组合(YR与yr、Yr与rR)中的一种，所以经减数分裂产生的四个精子只能是两种类型。同理，一个卵原细胞，经减数分裂后只能形成1个1种卵细胞。若有许多精原细胞和卵原细胞(基因型都是YyRr)时，就能形成4种精子和卵细胞。

答案：A

[例2]某个体的基因型为AABbDdeeFf，这些基因分别位于5对同源染色体上，问此个体产生配子的类型数是 ( )

A．4种 B．8种 C．16种 D．32种

剖析：许多考生易误将成对基因(AA、ee)算做等位基因，则错选D项。原因是若用n表示等位基因的对数，那么，杂种产生的配于类型是2n种。实际上此个体只有三对等位基因，所以产生的配子类型数应是23=8种。也即：AA →1种，Bb→2种，Dd→2种，ee→1种，Ff→2种，故AABbDdeeFf产生配子种类为1×2×2×1×2=8种。 答案：B

[例3]人类并指(T)对正常(t)为显性，白化病(a)对正常(A)是隐性，都在常染色体上，而且都是独立遗传。一个家庭中，父亲多指，母亲正常，他们有一个白化病但手指正常的孩子，则再生一个孩子患一种病和两病皆患的机率分别是 ( )

A．3／4，1／4 B．3／4，1／8 C．1／4，1／4 D．1／2，1／8

剖析：解此类题目时，可根据题意先分别对每对相对性状及其基因型作出分析：可逆推(从孩子表现型分析基因型推出双亲基因型)，孩子不并指，则基因型是tt，可推出父亲基因型为Tt(并指)、母亲tt(不并指)；孩子白化病，则基因型为aa，而父母均不得白化病可推知基因型均是Aa，从而得出这对夫妇的基因型分别是： (父)TtAa×(母)ttAa

根据双亲的基因型推算后代的表现型及比值，常用的方法有两种。

方法1是棋盘法，此法易懂但比较繁琐。方法2是相对性状“隔离”法，即用遗传概率相乘法则和相加法则计算出所生后代的概率。Tt×tt后代1/2并指(Tt)，1/2正常；Aa×Aa所生后代3／4正常(AA，2AA)，1／4白化病(aa)。将其相乘得各种表现型的概率为：

正常的概率为：1/2×3/4=3/8

只患并指的概率为：1/2×3/4=3/8

只患白化病的概率为：1/2×1/4=1/8

患并指又白化病的概率为：1/2×1/4=1/8

只患一种病的概率为3/8+1/8=1/2 答案：D

[例4]具有三对相对性状的纯合体杂交，按自由规律遗传，在F2中出现重组类型并且能稳定遗传的个体约占总数的多少

剖析：这是一道概率计算题，如果运用常规解法是很麻烦的，且花费时间较长。对于类似这样的题目，有公式： 2n-2/4n，其中n表示相对性状的对数，运用该公式解这样的题，效率高，速度快，可直接得出结论即：23－2／43＝3／32。

注：本公式的适用范围是在完全显性的条件下，对分离规律和自由组合规律适用，而对连锁互换规律则不适用。

答案：3／32

[例5]有关遗传的下列四种说法请你判断

(1)基因型为Dd的豌豆在进行减数分裂时；会产生雌雄两种配子，其数量比接近1∶1

(2)基因自由组合规律的实质是，在Fl产生配子时，等位基因分离，非等位基因自由组合；

(3)将基因型为Aabb的玉米花粉授到基因型为aaBb的玉米穗上，所结籽粒胚乳的基因型为AaBb、 Aabb、aaBb、aabb。 ( )

A三种说法都对

B．三种说法都不对

C．至少有一种说法对

D．有一种说法不对

剖析：(1)是对课本中“在F1(Dd)进行减数分裂时， 等位基因随着同源染色体的分开而分离，最终产生了含有基因D和d的两种雌配子和两种雄配子，它们之间的比接近1∶1这段话的误解。课本中所说是指含有D和含有d的雄配于之比为1∶1，合有D和含有d的雌配子之比为1∶1，而不是指含有D和d的雌配子和雄配子的数量比。实际上，含D和d的雄配子比含D和d的雌配子数量多得多。

(2)等位基因与非等位基因的概念是相对而言的，在一对同源染色体的不同位置上的或位于非同源染色体上的基因，都可称之为非等位基因。只有非同源染色体上的基因才能表现为自由组合，而位于同一对同源染色体不同位置上的非等位基因不能进行自由组合。

(3)因为胚乳是由一个精子和两个极核受精发育而来，所以应为三倍体(3N)。又因为父本Aabb减数分裂产生Ab和ab两种等比的精子，母本aaBb减数分裂产生aB和ab两种等比的卵细胞或极核(两个极核的基因型总是相同)，因此胚乳的基因型应为：AaaBBb、Aaabbb、 aaaBBb、aaabbb。 答案：B

[例6]基因型Ab/aB为 的生物体，减数分裂时，重组新类型的配子占总配子的30％，问此生物体内，一个发生着互换现象的初级卵母细胞产生一AB型卵细胞的可能性是 ( )

A30％ B．60％ C．25％ D．15％

剖析：考生易误选D项。原因一是审题不清，二是受思维定势的影响，认为互换率为30％，产生的四种配子的比为：Ab∶aB∶AB∶ab=35∶35∶15∶15，立刻选了D项。实际上交换重组率是对某个体产生的所有配子群体中重组类型配子的统计说明，而不是对一个母细胞产生子细胞类型可能性的分析。AaBb的一个卵原细胞可以产生4个4种基因型的子细胞：AB、Ab、aB、ab，其中的一个是卵细胞，其余三个是极体，这4个子细胞从理论上分析都有成为卵细胞的可能性，可能性都是1／4。 答案：C

[例7]某生物个体经减数分裂产生的配子种类和比例是：Ab∶aB∶AB∶ab＝4∶4∶1∶1。该生物如自交，其后代出现显性纯合体的概率是 ( )

A．1／6 B、1／64 C．1／100 D．1／160

剖析：从该生物产生的配子种类和比值(两多两少)可知，其基因与染色体的关系是： Ab/aB，互换率为1+1/10×100％=20％。解答此题比较简便的方法是用概率相乘法则，因为该生物产生的含AB的雌、雄配子各占总配子的1／10，所以AB雌配子与AB雄配子结合的概率为1／10×1／10＝1／100。同理可求出AAbb个体的概率为4／10×4／10＝10／100。此题也可用棋盘法解，但应特别注意的是配子系数，不然易出错误。 答案：C

[例8]有甲、乙、丙、丁、戊五只猫，其中甲、乙、丙都是短毛，丁和戊是长毛，甲和乙是雌性，其余都是雄性。甲和戊的后代全部是短毛，乙和丁的后代长、短毛都有。欲测定丙猫的基因型，与之交配的猫应选择 ( )

A．甲猫 B．乙猫 C丁猫 D．戊猫

剖析：由于此题涉及到的个体较多，再加上个体的显隐性、基因型都不知道，所以考生感到不知从何下手。解答此类题应首先理顺关系，将已知条件标出，然后退步分析。甲(短毛)、乙(短毛)、丙(短毛)、丁(长毛)、戊(长毛)由于甲×戊→全短毛推出，短毛对长毛为显性，且甲基因型为AA、戊为aa、丁为aa，由乙×丁→长毛、短毛，推知乙猫的基因型为Aa。欲确定丙猫的基因型是AA还是Aa，与之交配的猫只能是甲、乙两雌猫之一，因甲猫为AA，所以只能与乙猫交配。若所生后代全为短毛，则丙为AA，若后代长毛、短毛都有，则丙为Aa。 答案：B

[例9]下图所示为某家族中白化病遗传图谱。请分析并回答下列问题(以A、a表示有关的基因)：

(1)该致病基因是 性的。

(2)5号、9号的基因型分别是 和

(3)8号的基因型是 (比例为 )或 (比例为 )；10号的基因型是 (比例为 )或 (比例为 )。

(4)8号与10号属 关系，两者不宜婚配，因为如果婚配，后代中白化病的几率是 。

剖析：本题考查的是基因分离规律的基础知识以及对遗传系谱的分析能力。解答此类问题，首先应当全面、细致地审题、审图，针对所问，弄清已知、求解。因为7号、9号患病，其父母表现正常，可判断此病为隐性遗传，7号和9号的基因型为aa，则3号、4号、5号、6号的基因型均为Aa。本题的失误率较高。主要错在(3)和(4)题的几率计算上。其原因是不会求遗传几率，死记硬背遗传的分离比。如(3)小题，很多同学错答为1／4、1／2。他们以为Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ5、Ⅱ6都是杂合体，他们的后代基因型及其比值是1AA∶2Aa∶1aa，8号和10号是AA的几率为1／4，Aa的几率为2／4＝1／2。但他们忽略了8号和10号表现型为正常，所以计算几率时，就不应把aa再考虑进去，应按1AA：2Aa，即AA为1／3，Aa为2／3考虑。不少同学把(4)小题错答为1／4，误认为8号和10号都是携带者(Aa)，生白化病孩子(aa)的几卒为1／4(按自交实验的思路判断的)。实际上8号和10号究竟基因型是AA还是Aa，并没有肯定。所以计算生出病孩子的几率就应把他们是杂合体的几率2／3考虑进去，即1／4×2／3×2／3＝1／9。

答案：(1)隐 (2)Aa aa (3)AA(1／3)Aa(2／3)AA(1／3)Aa(2／3) (4)近亲 1／9

[例10]在完全显性条件下，基因型AaBbcc与aaBbCC的两亲本进行杂交，其子代中表现型不同于双亲的个体占全部子代的 。

剖析：要想正确地回答这一问题，在解题过程中要学习孟德尔分析问题的方法：一对性状、一对性状地进行分析。AaXaa→1Aa∶1aa子代中表现型有1／2同第一亲本，1／2同第二亲本；Bb×Bb→1BB∶2Bb∶1bb，子代表现型中3／4同双亲，1／4不同于双亲；cc×CC→Cc子代表现型都与第一亲本不同，都与第二亲本相同。由以上可知杂交后代的表现型都与第一亲本不同，所以与第二亲本不同的一定也与第一亲本不同。先算出与第二亲本相同的即1／2× 3／4×1，再算与第二亲本不同的为1－1／2×3／4x1＝5／8。

答案：5／8

(例1)一个患白化病的女性(其父为血友病患者)与一个正常男性(其母为白化病患者)婚配，这对夫妇所生子女中，血友病和白化病兼发的患者几率为 ( )

A、0 B．12．5％ C．25％ D、50％

剖析；此题涉及两对相对性状的遗传，白化病是常染色体隐性遗传病，设致病基因为a；血友病是伴X染色体隐性遗传病，设致病基因为h。解题思路：①首先应确定夫妇双方的基因型。根据题目设定的条件：白化病女性的父亲为血友病，其基因型应是aaXHXh；正常男性的母亲是白化病，其基因型应为AaXHY。②再根据夫妇双方的基因型计算后代中同时患两病的几率。其方法有

以下几种。

方法一：棋盘法

其中两病兼发患者(aaXhY)比例为1／8＝12．5％。

方法二：利用雌雄配子各自所占的比例求解。从双亲的基因型可看出，后代两病兼患的基因型应为aaXhY，它是由含aXh基因的卵细胞和aY基因的精子结合而成的。aXh占所有雌配子的比值为50％；而aY占所有雌配子的比值为25％，因此，aaXhY出现的几率为50％X25％=125%

方法三：将自由组合规律的题目转化为分离规律去解。先考虑白化病遗传，因母亲是白化病患者(aa)，父亲为杂合正常(Aa)，故其后代中患白化病(aa)的几率为50％。再考虑血友病遗传，因母亲是血友病携带者(XHXh)，父亲正常(XHY)，故其后代中患血友病(XhY)的几率为25％。由此得出后代中同时患两种遗传病的几率是50％×25％=12．5％。 答案:B

[例2]某色盲男孩的父母、祖父母和外祖父母中，除了祖父是色盲外，其他人色觉均正常。这个男孩的色盲基因来自 ( )

A．祖父 B．祖母 C、外祖父 D．外祖母

剖析：此题主要考查的知识点是色盲遗传病的遗传特点。但此题有一定迷惑性，如果不掌握色盲病遗传的特点常会错选答案A。解此题的思路是逆推，由于色盲是位干X染色体上的隐性遗传病，其遗传特点是交叉遗传，即色盲男孩的致病基因一定来自他的母亲，由于他的外祖父色觉正常，故其母亲的色盲基因只能来自其外祖母。 答案：D

[例3]一对表现型正常的夫妇，他们的双亲中都有一个白化病患者。预计他们生育一个男孩白化病的几率是( )；生育一个白化病男孩的几率是( )

A．12．5％ B．25％ C．50％ D．75％

剖析：该题所设的两个问题，许多同学将其混为一谈，实际上是有区别的。白化病为常染色体隐性遗传，设致病基因为a，因该夫妇的双亲中都有一个白化病患者，所以该夫妇的基因和染色体组成是AaXY与AaXX，则这对夫妇生白化病孩子的几率为25％，与性别无关，理论上分析白化病中男性、女性比例相同，故他们生育一个男孩白化病的几率是25％；根据性别决定，子女中性别比为男∶女＝1∶1，所以后代中基因和染色体组成为aaXY的白化病男孩的几率＝白化病几率×男孩的性别比；25％×50％＝12．5％。 答案：B A

[例4]下列遗传图谱中遗传病的遗传方式最可能是 ( )

A．常染色体显性遗传

B．常染色体隐性遗传

C．伴X染色体显性遣传

D、伴X染色体隐性遗传

剖析：解答此类题目，最常用的方法是反证法，即将各答案依次代入遗传图谱，看是否与题干相符。首先可淘汰D项，因为假设是X染色体上的隐性遗传(设基因为A和a)，亲代基因型分别为XaXa与XAY，则第二代中男性应均为患者，女性均正常，这与题干不相符，故D不成立。然后比较A、B、C三项，虽然这三者都有可能，但从图谱可看出，此遗传病在连续三代中有明显的连续性，所以A、C的可能性比B大。如果为A项，则第三代中男女患病的几率应相等，但系谱中只有女性患者，虽然实际中也有这种可能，但几率很小，故C的可能性比A的可能性还要大。 答案：C

[例5]一位遗传学家在研究甲、乙、丙三只果蝇的两对相对性状的遗传现象时，发现三只果蝇的基因型分别是：EFf(甲)、EeFf(乙)、eFf(丙)。

(1)这两对基因分别在哪类染色体上 。

(2)三只果蝇中，属于雄性的是 。

(3)甲果蝇形成的配子种类及比例可表示为 。乙果蝇形成的配子种类及比例可表示为 。

剖析：本题以基因的分离规律、自由组合规律和伴性遗传为命题材料，测试考生分析问题和解决问题的能力以及归纳、综合、推理的思维活动能力。在生物的体细胞中为什么有的基因成对存在有的基因成单存在这是由于生物体细胞中的每对常染色体的大小、形态都相同，因而位于常染色体上的基因都是成对存在的，同理，在含有同型性染色体的个体中，性染色体上的基因也是成对存在的，而在含有异型性染色体的个体中，性染色体上的基因往往成单存在(因其两条性染色体结构不同)。由题意可知，甲中的E基因成单存在，丙中的e基因成单存在，说明E、e基因都位于X染色体上，且可推知甲、丙只含有一条X染色体，故两者均为雄性果蝇。乙中E、e成对存在，说明乙中含有两条X染色体，故乙为雌性果蝇。F、f基因在雌雄果蝇中都成对存在，说明Ff位于常染色体上。在减数分裂形成配子时，位于性染色体上的基因随两条性染色体的分开而分离；同时与另一对常染色体上的基因自由组合。

因此，甲果蝇(XEYFf)形成的配子种类及比例为： FXE∶fXE∶FY∶fY=1∶1∶1∶1,乙果蝇(XEXeFf)形成的配子种类及比例为：FXE∶FXe∶fXE∶fXe=1∶1∶1∶1

答案：(1)E与e基因位于X染色体上，F与f基因位于常染色体上；

(2)甲、丙

(3)FXE∶fXE∶FY∶fY=1∶1∶1∶1 FXE ∶FXe∶fXE∶fXe=1∶1∶1∶1

[例6）（1999年上海)果蝇的红眼(W)对白跟(w)为显性，这对等位基因位于X染色体上，下图表示一红眼雄果蝇与一红眼雌果蝇分别通过减数分裂产生配子，再交配生出一白眼雄果蝇的过程。请据图回答：

(1)写出图中A、B、E细胞的名称： A B ，E 。

(2)画出图中C、D、G细胞的染色体示意图。凡X染色体上有白眼基因的用w记号表示。

C D G

(3)若精子C与卵细胞F结合，产生后代的基因型为 ，表现型为 。

(4)着亲代红眼雌果蝇与一白眼雄果蝇交配，则子代总数中出现雄性红眼果蝇的概率为 ，出现雄性白眼果蝇的概率为

剖析：本题是一道典型的细胞水平与分子水平相结合的综合遗传题，涉及减数分裂、伴性遗传等知识，同时考查了学生的识图和绘图能力。解答此题的思路是，应先从图入手，分清各细胞之间的相互关系和图解的含义。再具体计算各种后代出现的概率。

(1)题中的连续图解，左边为精子的形成过程，右边为卵细胞的形成过程，红眼雄果蝇细胞经DNA复制形成的A再经两次分裂形成配子，推断A为初级精母细胞，B为精子细胞，C为变形后的精子。红眼雌果蝇的细胞D，经DNA复制和第一次不均等分裂形成E，则D为卵原细胞，E是不均等分裂的大者，为次级卵母细胞，E分裂的大者F为卵细胞，G是由与E同时形成的极体经第二次分裂而得，故G为第二极体。

(2)据题意知，红眼雄果蝇的基因型为XWY，而红眼雌果蝇至少有一条X染色体上含有W基因，基因型可先设为XWX－(—代表待定)。由图可知，卵细胞F与其中一个精子结合形成了白眼雄果蝇，基因型为XWY。因卵细胞只合X染色体，由此可推断：①卵细胞F中含Xw，则亲代红眼雌果蝇的基因型为XWXw；②B细胞和与B来自干同一个次级精母细胞的配子含Y染色体，另两个雄配子(包括精子C)中含有X染色体；③第一极体分裂得到的两个第二极体(包括G)中含有XW。

(3)精子C与卵细胞F结合，后代的基因型为XWXw，为红眼雌果蝇。

(4)亲代红眼雌果蝇(XWXw)与白眼雄果蝇(XwY)交配，因XWXw可产生两种雌配子XW∶Xw=1∶1，XwY也可产生两种雄配于Xw∶Y=1∶1，所以其后代为雄性红眼果蝇(xWY)的概率是：1／2×1／2＝1／4；后代为雌性白眼果蝇(XwXw)的概率为：1／2×1／2=1／4。也可用图解法求出。

答案：(1)初级精母细胞 精子细胞 次级卵母细胞

(2)如右图（3）XWXw 红眼雌果蝇 （4）1／4 1／4

重点难点精析]

1．性别决定的因素有哪些

性别主要是由性染色体来决定。但也受到受精与否、环境和激素、基因差异、染色体数目等因素的影响。不同生物的性别决定方式是有差别的。

2．伴X染色体隐性遗传的特点(以色盲为例)

(1)男性患者多于女性患者。因为男性只要含有一个致病基因即XbY，就患色盲；而女性必须同时含有两个致病基因即XbXb，才会患色盲。所以患者男性多于女性。

(2)隔代遗传(或交叉遗传)。因患者多为男性，而男性患者的致病基因一定采自其母亲，且只能传给他的女儿，所以典型的遗传过程是：外公→女儿→外孙，表现为隔代遗传。

3．伴性遗传与基因遗传规律的关系

性染色体及其所含基因的活动规律与常染色体及其基因的活动规律是一致的。但由于性染色体与常染色体在结构上的差异，从而导致性染色体的活动表现出伴性遗传的特殊现象，但是，它仍然遵循核遗传的三个基本规律：减数分裂形成配子时，性染色体上的基因随两条性染色体的分开而分离；性染色体上的基因与常染色体上的基因可以自由组合；性染色体上的基因超过两个时，就出现基因的连锁互换。

4．人类遗传病的遗传方式的判断

根据控制人类遗传病的基因在染色体上的位置和基因的显、隐性关系，可将人类遗传病分为五种类型，即；常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、伴X染色体显性遗传、伴X染色体隐性遗传和伴Y染色体遗传。怎样根据遗传系谱图来区分它们呢这是本节中难点中的难点；下表为常见遗传病的代表图，据此可解决此类问题。

25 根据遗传系谱图，分析致病类型及概率的计算：无中生有为隐性；如为无中生女有则为常染色体隐性，否则如出现母患儿必患则为性染色体隐性遗传；有中生无为显性，如出现父患女必患，则为性染色体显性遗传，否则就不一定了

特殊用途载体

载体（Vectors）DNA：　1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区（encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的；　2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。所以，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因工程载体。

载体（Vectors）定义：在基因工程 *** 作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。

多克隆位点(multiple cloning site)ori复制起始点遗传标记pUCMCSAmpr运送外源基因高效转入受体细胞2、为外源基因提供复制能力或整合能力3、为外源基因的扩增或表达提供条件

载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，在很大程度上决定于载体。

基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。（2）有选择性标记Ampr、Tetr、Kanr等。

（3）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。（4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。（5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。外源DNA插入其中不影响载体的复制且切点是单一的，这样可将多个外源DNA 片段插入其中。避免基因的非控制性扩散。（6）具有对受体细胞的可转移性。（7）具有较好的安全性，不能任意转移。

大肠杆菌质粒载体pBR322结构图克隆位点克隆位点遗传标记基因复制起点 

载体的种类按功能分类克隆载体克隆一个基因或DNA片断表达载体用于一个基因的蛋白表达整合载体把一个基因插入到染色体组中

表达载体　用于一个基因的蛋白表达　整合载体　把一个基因插入到染色体组中按来源分类　质粒载体　噬菌体载体　柯斯质粒载体　人工染色体载体00 

载体的种类和特征质粒   受体细胞结构插入片断举例Ecoli   环状＜8kb pUC18/19 , T-载体等λ噬菌体线状

EMBL系列，λ gt系列丝状噬菌体及噬菌粒＜10 kbM13mp系列粘粒载体35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCVBAC (Bacterial Artificial Chromosome)≈300 kbPel oBAC系列YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母细胞线性染色体kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳类细胞＞1000 kb病毒载体动物细胞SV40 载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体和细菌pSVK3质粒，PBV, Ti质粒

第一节克隆载体1   质粒载体（plasimid vectors）2   噬菌体载体（phage vectors）

第一节克隆载体1 质粒载体（plasimid vectors）2 噬菌体载体（phage vectors）3 柯斯质粒载体（cosmid vectors）4 人工染色体载体（B/Y/HAC）

质粒的生物学特性（1）质粒的概念的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。

质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等）。

（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。（3）质粒的生存

严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）(拷贝数少，为1-5个) 

（4）质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）(拷贝数少，为1-5个)松弛型复制控制的质粒（relaxed）(拷贝数多，可达10-200个拷贝)因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。

（5）质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相同的复制子。

（6）质粒的可转移性在天然条件下，很多天然质粒都可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。Conjugative plasmid 接合型质粒（自我转移的质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。Non Conjugative plasmid 非接合型质粒（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发的转移到另一个细胞。基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分子 *** 作过程中质粒在细胞中的稳定性。

Tra protein from conjugative plasmid

bom siteMob genemob mRNAMob proteinopenrecipient cellhelper plasmid即mob基因的产物可打开非接合质粒的bom 位点(oriT位点)，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用(mobilization)。

质粒DNA的tra基因　EColi产生菌毛　宿主与受体细胞结合　遗传物在细胞之间转移（指令）（迁移）大肠杆菌接合（conjunction）

（7）携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱　这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义

遗传标记基因定义:在基因工程中使用与选择重组体DNA转化细胞的基因1 指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞2 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子标记基因的作用

标记基因的种类1   抗性标记基因（可直接用于选择转化子）

a 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neorb 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdrc 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因2 营养标记基因（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3 生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ，GUS，CAT4 噬菌斑

1四环素抗性基因（Tcr）Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。2氨苄青霉素抗性基因（Apr）Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。3 氯霉素抗性基因（Cmr）Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。20 

质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。

（8）质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。双螺旋共价闭合环（超螺旋）线状双螺旋（两个裂口）开环双螺旋（一个裂口）

质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。OC L SC 

天然质粒的局限性天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。

质粒载体的命名原则人工组建的质粒人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322，字母p代表质粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表…构建的一系质粒的编号。

质粒载体的发展概况第一阶段（1977年前）　天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, ColE1, pCR, pBR313和pBR322。第二阶段　增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。第三阶段　完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。

质粒载体的构建质粒构建基本策略1加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选择转化体2增加或减少合适的酶切位点，便于重组

3缩短长度，提高导入效率，增加装载量4改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝5根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件

1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS

质粒构建原则1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS2、正确获得构建质粒载体的元件：酶切、PCR3、组装合适的选择标记基因4、选择合适的启动子5、提高外源DNA的容量灭活一些有害基因，比如与质粒移动有关的基因，或影响质粒复制的负调控基因等。6、需要灭活初始质粒上的某些编码基因7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单

质粒载体：作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。

质粒载体的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000   扩增基因

高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数 扩增基因低拷贝质粒来自pSC101 拷贝数小于10表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点　便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子　便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒装有报告基因　便于启动子等元件的克隆筛选

质粒载体的分类（1）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1、pMB9   松弛型质粒。具有低分子量、高拷贝数的优点。

具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数1000－3000个！用途：适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。

（2）低拷贝数的质粒载体（3）温控的质粒载体由pSC101派生来的载体。特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等

适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。（3）温控的质粒载体一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2温度低（<37 oC），拷贝数很少；温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个。

（4）插入失活型质粒载体如pDF41、pDF42、pBR322。无抗生素抗性抗生素抗性

载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。外源DNA片段插入会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmr等）失活。如pDF41、pDF42、pBR322。外源DNA无抗生素抗性抗生素抗性

质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。

（5）正选择的质粒载体质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型，直接选择转化后的细胞，提高了选择的敏感性。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expression vectors）。一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体（图4-11）的主要组成部分，包括大肠杆菌的启动子及 *** 纵全点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。

经典的大肠杆菌质粒载体pSC101质粒载体天然质粒，属严紧型低拷贝质粒。909 kb。四环素抗性Tetr。

ColE1天然质粒，属松弛型、高拷贝质粒，66Kb。有氯霉素扩增效应，每个细胞拷贝

大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）

选择标记大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成噬菌斑。•colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。•唯一的克隆位点EcoR I 正好位于这个基因的内部。可以通过插入失活筛选。

③不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因

ceaimmkil结构基因免疫基因溶菌基因②杀死不含有ColE1细菌的原因cea + kil基因产物产生菌对细菌素有自身免疫性大肠杆菌所产生的细菌素称为大肠菌素(colicin),它除作用于某些型别的大肠杆菌外,还能作用于亲缘关系相近的志贺菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌和巴氏杆菌等。③不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因imm基因

EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。

唯一的克隆位点EcoR IEcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。Colicin E1外源DNA无Colicin用对外源colicin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作选择， *** 作非常繁杂。

pBR322：人工构建载体p:质粒；BR：质粒两位主要构建者姓氏的第一个字母；322：实验编号三个亲本质粒：

pSF2124pMB1pSC101三个亲本质粒：pMB1:出发质粒(ColE1)pSF2124: AmprpSC101: Tetr把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。436kb的环状双链DNA，碱基序列已经全部清楚。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。

3个会导致Ampr基因失活9个导致Tetr基因失活氨苄青霉素和四环素抗性24个单一克隆位点。

pBR322的优点①双抗生素抗性选择标记抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重组体质粒的有效方法，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞®在Amp或Tet中都死亡。获得重组载体的寄主细胞®在Amp或Tet其中之一中死亡。

不含质粒载体含有空质粒载体含有重组质粒载体AmpAmp＋Tet

pBR322重组克隆的筛选重组克隆的“插入失活”筛选方法pBR322—→插入在Tetr中，基因型为Tets 、Ampr——→在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长；pBR322—→插入在Ampr中，基因型为Tetr 、Amps、——→在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长；　而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。

②分子小，克隆能力大③高拷贝数④安全⑤具有较多的单一酶切位点（24种）

长度4363bp，易于纯化，可以携带6-8Kb的外源DNA片段。③高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可1000~3000copies④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。载体越小越好。>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。缺失流动基因（mob）。这样，质粒就不会从一个细菌接触转移到⑤具有较多的单一酶切位点（24种）

pBR322的缺点保留了转移蛋白（mob）的作用位点。能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！

PBR322的改进①删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。pAT153：从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。

②改造EcoR I 位点pBR325：使EcoRI 也成为插入失活型位点。在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也带一个EcoRI位点。

pUC系列载体在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19

加入一个在5端带有10个多克隆位点的基因lacZ’

（1）元件来源a ori来自pBR322质粒的复制起点b   标记基因（ampr）:pBR322的Ampr基因

Lacz基因编码的半乳糖苷酶是四聚体。Lacz’基因含有lacz基因的前59个密码子，a序列，编码a肽。c lacz’基因：大肠杆菌lac *** 纵子DNA区段，编码β-半乳糖苷酶a-肽链，是LacZ氨基端的一个片段载体用于可编码半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。d MCS 多克隆位点。

（2）克隆位点具有MCS（多克隆位点）区段：位于lacZ’基因的5’端。10个连续的单一限制酶切位点，但它不破坏该基因功能。

有mcs的存在，lacz’基因仍然能编码a肽。如果外源基因插入此mcs区，该基因失活。

x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，为生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal   蓝色

菌落蓝白选择的原理：IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，乳糖类似物，又称为安慰诱导物，可代替乳糖诱导乳糖 *** 纵子结构基因的表达，即可诱导lacz’所编码的半乳糖苷酶氨基末端片段（α－肽）的合成。x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，为生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal蓝色x－gal水解后呈现蓝色

α-互补：pUC类载体带有lacz’基因，编码半乳糖苷酶氨基端片段（α-肽），此片段与宿主细胞所编码的羧基端半乳糖苷酶实现基因内互补，形成有功能的半乳糖苷酶，称α-互补。

α-互补（α-complementation）α-互补是指lacZ 基因上缺失近 *** 纵基因区段的突变体与带有完整的近 *** 纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖lac *** 纵子中的lacZ 基因编码β-半乳糖苷酶，如果lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。例如，lacZ△M15 基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第个氨基酸的lacZ 基因，无酶学活性。对于只编码N-端140 个氨基酸的lacZ 基因（称为lacZ'），其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。

菌落蓝白斑选择的原理：在基因克隆时，细菌在含有IPTG和x－gal的培养基中进行培养。IPTG诱导质粒的lacz’基因产生α-肽，同时诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片段。两种片段形成有功能的半乳糖苷酶，从而使x－gal水解，产生蓝色物质，使非重组菌落呈现蓝色。当外源基因插到质粒的多克隆位点后，使lacz’失活，不能表达α-肽，破坏了互补作用，细胞内无有活性半乳糖苷酶，使带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。

互补显色反应 

a   具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达500-700个拷贝

PUC载体的优点：a 具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达个拷贝b 具有MCS片段，可把具有两种不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到pUC类载体上。26kbc 可以用组织化学方法检测重组体（蓝白斑筛选）

pGEM载体总长度为2743bp   含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个lacZ’编码基因

一段含有EcoR I、Sat I、Kpn I、Ava I、Sma I、BamH I、XbaI、Sall、AccI、Hinc I、Pst II、Sph I和Hind II等识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC18克隆载体的完全一样。

pGEM系列与pUC系列之间的主要差别pGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于Lac z’基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别T7或SP6启动子的RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。质粒载体pGEM-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T7这两个启动子的位置互换、方向相反而已。pGEM 系列与pUC 系列之间的主要差别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7 启动子和SP6 启动子，它们为RNA 聚合酶的附着提供特异性识别位点。由于这两个启动子分别位于lacZ‘ 基因中多克隆位点区的两侧，若在反应体系中加入纯化的T7 或SP6 RNA 聚合酶，便可以将已经克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA 。质粒载体pGEM-3Z 和pGEM-4Z 在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6 和T7 这两个启动子的位置互换、方向相反而已。

pGEM-3Z：多拷贝装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’   装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达

注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：Ecoli BL21（DE3）等

穿梭质粒载体这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞中复制并检测，例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。这类载体既具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析穿梭载体(shuttle vector)是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析61 

用Taq酶的PCR产物3’端加上了一个A。根据这一特点研制出一种线性质粒，其5’端突出的T，它们之间可以连接，即TA克隆。

When it comes to treating diseases like cancer, modern medicine has an impressive arsenal And one of its most versatile weapons are Y-shaped proteins called monoclonal antibodies Our immune systems already produce their own antibodies (plasma cell), they come in billions of variations, each matching a specific target, such as a particular toxin, bacteria or virus When they bind to their target, they send a signal, this bacterium is now marked for destruction These naturally- produced antibodies are pretty effective In the 1970s, scientist figured out how to mass produce them

今天和大家聊聊甲基化。

问：什么是表观遗传修饰？

答：基因组表观遗传修饰主要包括DNA甲基化修饰与核小体中组蛋白的修饰等，使得被修饰DNA的空间结构发生改变或使染色体结构发生改变，导致基因的沉默或过度表达。这两种修饰都是在不改变DNA碱基种类与数量的前提下使生物体表型呈现出多样化。

问：什么是DNA甲基化？

答：DNA甲基化是指在DNA 甲基化转移酶的作用下，将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5’-甲基胞嘧啶的过程。

问：DNA甲基化修饰有什么作用？

答：DNA甲基化是最早发现的一种表观遗传修饰，可能存在于所有高等生物中， 它并不改变基因的碱基序列， 而是通过改变基因的表达影响细胞的功能，与基因沉默、X染色体失活、基因组印记、RNA i以及肿瘤等生物事件密切相关，它们的共同作用机制是调节基因的表达。

问：不同生物，DNA甲基化类型是一样的吗？

答：当然不一样啦。原核生物中甲基化多发生在CCA/TGG和GATC序列，而真核生物中DNA甲基化一般只发生在CpG位点上，哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶，植物甲基化发生在CpG和CpNpG。

问：什么是CpG岛？

答：CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段CpG序列密度很高，可达到均值5倍以上即所谓的CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子（promotor）和第一外显子区域，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛。CpG岛的GC含量大于50%，经常出现在真核生物的编码基因的调控区。

问：CpG岛为什么要有个"p"，而不叫CG岛？p有什么特殊含意？

答：CpG是胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤的缩写，p代表磷酸。

问：如何预测CpG岛？

答：由于CpG 岛区域较小，研究起来更为方便，因此，众多的研究热点集中在CpG 岛甲基化状态的研究上。而研究CpG岛甲基化的前提条件是确认最合适的CpG 岛区域。

目前有一些网站可以进行CpG岛的预测，我推荐几个比较好用的：

CpG Island（ >

你好

我们都知道不论真核与原核生物都离不开基因，它储存着生长、发育、凋亡等几乎全部生命过程的信息。那么基因有着哪些结构呢，接下来从三个层面来讨论基因的构成：

一、DNA

编码区 Coding region

基因在结构上，分为编码区和非编码区两部分。真核生物的编码区是不连续的，分为外显子和内含子，在转录过程中会修剪内含子，并拼合外显子来形成转录产物。在原核生物中，基因是连续的，也就是说无外显子和内含子之分。

外显子 Exon

外显子是在 preRNA 经过剪切或修饰后，被保留的DNA部分，并最终出现在成熟RNA的基因序列中。

内含子 Intron

在真核生物中，内含子作为阻断基因的线性表达的一段DNA序列，是在 preRNA 经过剪切或修饰后，被切除的DNA序列

非编码区 Non-coding region

非编码区在对基因的表达调控中发挥重要作用，如启动子，增强子，终止子等都位于该区域，有意思的是在人类基因中非编码区的占比超过90%。它们中的一部分可以转录为功能性RNA，比如tRNA（transfer RNA）, rRNA（ribosomal RNA）等；可以作为DNA复制，转录起始来对复制，转录和翻译起到调控作用；也可能是着丝粒与端粒的重要组成部分。

启动子 Promoter

启动子是特定基因转录的DNA区域，启动子一般位于基因的转录起始位点，5‘端上游，启动子长约100-1000bp。在转录过程中，RNA聚合酶与转录因子可以识别并特异性结合到启动子特有的DNA序列（一般为保守序列），从而启动转录。启动子本身并不转录而且也不控制基因活动，而是通过转录因子结合来调控转录过程。在细胞核中，似乎启动子优先分布在染色体区域的边缘，可能是在不同染色体上共同表达基因。 此外，在人类中，启动子显示出每个染色体特有的某些结构特征。

CAAT Box 与 Sextama box

CCAAT box（有时也缩写为CAAT box或CAT box）：具有GGCCAATCT 共有序列的不同核苷酸序列 ，是真核生物基因常有的调节区，位于转录起始点上游约-80bp处，可能也是RNA聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。与之相似的是，在原核生物启动子上-35bp处的TTGACA区，又称-35区。

保守序列与共有序列的概念含义基本相同。保守序列间相似度高，但不一定相同，而共有序列是相同的，共有序列可以理解为一种特殊的保守序列。

CAAT框是最早被人们描述的常见启动子元件之一，常位于接近-80的位置，但是它可以在离起始点较远的距离仍能起作用，且在两种取向均可发挥作用。CAAT框的突变敏感性提示了它在决定转录效率上有很强的作用，但是突变对启动子的特异性没有影响。

TATA Box 与 Pribnow box

TATA 框（TATA box / Goldberg-Hogness box），存在于古细菌和真核生物的核心启动子区域的一段DNA序列，TATA 框的原核同源物称为Pribnow 框（Pribnow box），其具有较短的共有序列TATAATAAT。 它约在多数真核生物基因转录起始点上游约-30bp（-25~-32bp）处，基本上由A-T碱基对组成，是决定基因转录始的选择，为RNA聚合酶的结合处之一，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能起始转录。

增强子 Enhancer

增强子是位于转录起始位点或下游基因1Mbp的位置，长度50-1500bp的序列，其可以被转录激活因子结合从而增加特定基因转录发生的可能性，广泛的存在于原核与真核生物基因结构中。

增强子能大大增强启动子的活性。增强子有别于启动子处有两点:增强子对于启动子的位置不固定，而能有很大的变动;它能在两个方向产生相互作用。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一启动子。

终止子 Terminator

终止子处于基因或 *** 纵子的末端，给RNA聚合酶提供转录终止信号的DNA序列。

终止子与终止密码子的概念区分：二者在名称上相似，但是含义是截然不同的。终止子是处于基因的非编码区的一段DNA序列，用于终止转录。而终止密码子是在翻译过程中终止肽链合成的mRNA中的三联体碱基序列，一般情况下为UAA，UAG和UGA，不编码为氨基酸。

ATAAA

ATAAA 是 preRNA 在通过修剪后形成成熟mRNA 时在3'UTR产生ployA 是的加尾信号。但是这段序列并不是绝对保守，也可能为其他A富集的序列，比如AATAAA等。

回文序列 palindrome sequence

回文序列是双链DNA中的一段倒置重复序列，这段序列有个特点，它的碱基序列与其互补链之间正读和反读都相同。当该序列的双链被打开后，如果这段序列较短，有可能是限制性内切酶的识别序列，如果比较长，有可能形成发卡结构，这种结构的形成有助于DNA与特异性DNA与蛋白质的结合。

5' GGTACC 3'

3' CCATGG 5'

二、preRNA

转录起始位点 Transcription start sites (TSS)

转录起始位点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应的DNA链上的碱基，通常为一个嘌呤（A 或G），即5’UTR的上游第一个碱基。

5’末端的序列称为上游,而把其后面即3‘末端的序列称为下游

转录终止位点 Transcription termination sites (TTS)

转录起始位点是指新生RNA链最后一个核苷酸相对应的DNA链上的碱基。当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来。

开放阅读框 Open reading frame(ORF)

ORF 是连续的一段密码子，其含有起始密码子（通常是AUG）和终止密码子（通常是UAA，UAG或UGA）。在真核基因中，ORF跨越内含子/外显子区域，其可以在 ORF 转录后拼接在一起以产生蛋白质翻译的最终mRNA。 由于读写位置不同（对应不同的起始位点），ORF 可能翻译为不同的多肽链。

在原核生物如大肠杆菌基因组中，rRNA基因一共是七套；在真核生物中rRNA基因的重复次数更多。在真核生物基因组中18S和28S,rRNA基因是在同一转录单位中，低等的真核生物如酵母中，5SrRNA也和18S,28SrRNA在同一转录单位中；而在高等生物中，5SrRNA是单独转录的，而且其在基因组中的重复次数高于18S和28S基因。和一般的中度重复顺序不一样，各重复单位中的rRNA基因都是相同的。rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因组中，这样的区域称为rDNA，如染色体的核仁组织区（nucleolus organizer region）即为rDNA区。18S和28SrRNA基因构成一个转录单位。从转录单位上转录下来的rRNA前体经过酶切成为18S和28SrRNA。在哺乳动物和两栖动物中，18S和28SrRNA之间一同被转录下来的间隔区经过加工成为58SrRNA(在大肠杆菌中该区含有tRNA序列)。rRNA前体的其它部份被降解成核苷酸。真核生物中每个转录单位约长7-8kb（在哺乳动物中长13kb），其中编码rRNA的部份占70-80%（哺乳动物中只占50%左右）。一个rRNA基因簇（rDNA簇）含有许多转录单位，转录单位之间为不转录的间隔区，该间隔区由21-100bp片段组成的类似卫星DNA的串联重复顺序。转录单位和不转录的间隔区构成一个rDNA重复单位。由于不转录的间隔区中类似卫星DNA的串联重复次数不一样，因此，在不同生物及同种生物的不同rDNA重复单位之间不转录间隔区的长短相差甚大。非洲爪蟾的rDNA簇中，由类似卫星DNA的重复序列交替排列构成。5'端为一固定长度的独特顺序；后面的重复区域是由97bp的重复单位组成；另外两个重复区域是由60bp或81bp的重复单位构成；由于每个重复区域中重复单位的重复次数在不同的rDNA重复单位中不一样，因而造成不同的不转录间隔区的长短不一。另外两个固定长度的区域称为Bam岛（因为这两个片段的分离是采用BamHI酶消化制备的）。Bam岛的后半部与转录单位前面的序列（含有启动子）相似；另外在60/81bp的重复区域中也有类似的序列。根据这些结构特点，有人认为不转录的间隔区可能在转录单位的转录起始中起着重要作用。rDNA的重复单位在许多动物的卵子形成过程中进行大量复制扩增，如爪蟾在扩增前有rDNA重复单位500个，在从卵母细胞前身(oocyteprecursor)发展到卵母细胞过程中（3周时间），rDNA的重复单位可扩增400倍，每个细胞核的核仁数增加到几百个。扩增rDNA的过程是采用滚环式复制方式在核仁区进行的，扩增的DNA不纳入到染色体中，而是包含在核区。卵母细胞成熟后，大量的rDNA由于失去了存在的意义而逐渐降解。在卵子形成的过程中rDNA大量扩增的目的，就是为了产生大量的rRNA，组装成核糖体，用于合成大量的蛋白质，以满足受精后发育的需要。在大多数真核细胞中5SrRNA基因和18S,28SrRNA基因不属于一个转录单位。5SrRNA基因在基因组中亦呈串联重复排列成基因簇。其结构在非洲爪蟾中研究得最为清楚。在爪蟾体细胞中5SrRNA基因约有500拷贝，而在卵细胞中5S基因可重复20000多次。这大概是为了和卵细胞中大量扩增的28S和18S基因相统一。在爪蟾中发现有几种5SrRNA基因。最主要的一种其结构形式与18S、28S基因相似，即5S基因与非转录间隔区相间排列，组成一个重复单位。每个重复单位的5'端是含有A-T丰富区的一段49bp长的G-C丰富区；下面跟是120bp的5SrRNA基因;后面又是一段 并不转录的序列,而且与前面的5S基因比较有9个点突变，因此称为这段基因为假基因（pseudo gene）。尽管假基因不被转录，但在5S基因簇中总是有等量的5S基因和它的假基因。

在卵细胞中还有一个次要的5SrRNA基因，与主要的5S基因在序列上有一定和差异，在结构上与主要的5S基因相似，但整个重复单位长只有350bp,而且间隔区与主要的5S基因完全不一样。

人类的rRNA基因位于13,14,15,21和22号染色体的核仁组织区，每个核仁组织区平均含有50个rRNA基因的重复单位。5SrRNA基因似乎全部位于1号染色体（1q42-43）上，每单倍体基因组约有1000个5SrRNA基因。tRNA基因的清确重复次数比较难以估计。在非洲爪蟾中约有300个拷贝由tRNAmet,tRNAphe,tRNATrp及其它tRNA基因组成的318kb的串联重复单位。而在人体单倍基因组中约有1000-2000个tRNA基因，为50-60种rRNA编码，每种平均重复20-30次。 组蛋白基因在各种生物体内重复的次数不一样，但都在中度重复的范围内。通常每种组蛋白的基因在同一种生物中拷贝数是相同的。鸡的基因组中组蛋白基因有10个拷贝，在哺乳动物中为20拷贝，非洲爪蟾为40拷贝，而海胆的每种组蛋白的基因达300-600拷贝。不同生物中组蛋白基因在基因组中的排列不一样，组蛋白基因没有一定的排列方式，而在拷贝数高的基因组中（>100拷贝），大部份组蛋白基因串联重复形成基因簇。

海胆发育早期五种组蛋白基形成一个重复单位，每种组蛋白基因之间是非转录间隔区，5个间隔区均不相同。这样的重复单位在整个基因组中重复300次以上，而且这些重复单位基本上是相同的。在海胆中，5种组蛋白基因的转录方向都是相同的，每种组蛋白基因独立的产生自己的mRNA。非洲爪蟾卵细胞5S基因重复单位包括一个基因和一个假基因。在三种不同的海胆中，其组蛋白基因重复单位中非转录间隔区在长度和序列上差异是很大的，尽管它们的组蛋白基因的长度和序列相差不多。实际上，在同一种海胆内不同的组蛋白基因重复单位之间，相应的非转录间隔区也不是完全相同的。另外，在海胆胚胎发育晚期，要由晚期组蛋白基因来编码组蛋白，该基因与上述的早期组蛋白基因有轻微的差异，但该组蛋白基因不成簇排列，整个基因组仅有10个拷贝，呈散在分布。

在果蝇和非洲爪蟾中，5种组蛋白也排成一个重复单位，也存在间隔区，而且组蛋白基因的转录方向不一样。多个重复单位也形成串联重复排列。进化到哺乳动物，组蛋白基因一般不再形成重复单位，而呈散在分布或集成一小群。尽管组蛋白基因在基因组中的排列和分布在不同生物之间相差甚大，但是所有组蛋白基因都不含内含子，而且在序列上相应的组蛋白基因都很相似，从而编码的组蛋白在结构上和功能上也极为相似。

基因组中存在大量重复序列用以编码组蛋白是有其重要意义的。DNA复制时，组蛋白也要成倍增加，而且往往在DNA合成一小段后，组蛋白马上就要与其相结合，这要求在较短的时间内合成大量的组蛋白，因而需要有大量的组蛋白基因存在。人体基因组中还有几个大的基因簇，也属于中度重复顺序长的分散片段型。在一个基因簇内含有几百个功能相关的基因，这些基因簇又称为超基因（Super gene），如人类主要组织相容性抗原复合体HLA和免疫球蛋白重链及轻链基因都属于超基因。超基因可能是由于基因扩增后又经过功能和结构上的轻微改变而产生的，但仍保留了原始基因的结构及功能的完整性。

基因的自由组合定律与应用：

1．自由组合定律：控制不同性状的遗传因子的分离和组合是互不干扰的；在形成配子时，决定同一性状的成对的遗传因子彼此分离，决定不同性状的遗传因子自由组合。

2 实质

(1)位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的。

(2)在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。

3．适用条件

(1)有性生殖的真核生物。

(2)细胞核内染色体上的基因。

(3)两对或两对以上位于非同源染色体上的非等位基因。

4．细胞学基础：基因的自由组合定律发生在减数第一次分裂后期。

5．应用

(l)指导杂交育种，把优良性状重组在一起。

(2)为遗传病的预测和诊断提供理沦依据。

两对相对性状的杂交实验：

1．提出问题——纯合亲本的杂交实验和F1的自交实验

(1)发现者：孟德尔。

(2)图解：

2．作出假设——对自由组合现象的解释

(1)两对相对性状（黄与绿，圆与皱）由两对遗传因子（Y与y，R与r）控制。

(2)两对相对性状都符合分离定律的比，即3:1，黄：绿=3：1，圆：皱=3：1。

(3)F1产生配子时成对的遗传因子分离，不同对的遗传因子自由组合。

(4)F1产生雌雄配子各4种，YR：Yr：yR：yr=1:1:1:1。

(5)受精时雌雄配子随机结合。

(6)F2的表现型有4种，其中两种亲本类型（黄圆和绿皱），两种新组合类型（黄皱与绿圆）。黄圆：黄皱：绿圆：绿皱=9：3：3：1

(7)F2的基因型有16种组合方式，有9种基因型。

3对自由组合现象解释的验证

(1)方法：测交。

(2)预测过程：

(3)实验结果：正、反交结果与理论预测相符，说明对自由组合现象的解释是正确的。

自由组合类遗传中的特例分析9：3：3：1的变形：

9：3：3：1是独立遗传的两对相对性状自由组合时出现的表现型比例，题干中如果出现附加条件，则可能出现9：3：4、9：6：1、15：1、9：7等一系列的特殊分离比。

特殊条件下的比例关系总结如下：

条件

种类和分离比

相当于孟德尔的分离比

显性基因的作用可累加

5种，1：4：6：4：1

按基因型中显性基因个数累加

正常的完全显性

4种，9：3：3：1

正常比例

只要A（或B）存在就表现为同一种，其余正常为同一种，其余正常表现

3种，12：3：1

（9：3）：3：1

单独存在A或B时表现同一种，其余正常表现

3种，9：6：1

9：（3：3）：1

aa(或hb)存在时表现为同一种，其余正常表现

3种，9：3：4

9：3：（3：1）

A_bb(或aaB_)的个体表现为一种，其余都是另一种

2种，13：3

（9：3：1）：3

A、B同时存在时表现为同一种，其余为另一种

2种，9：7

9：（3：3：1）

只要存在显性基因就表现为同一种

2种，15：1

（9：3：3）：1

注：利用“合并同类项”巧解特殊分离比

(1)看后代可能的配子组合，若组合方式是16种，不管以什么样的比例呈现，都符合基因自由组合定律。

(2)写出正常的分离比9：3：3：1。

(3)对照题中所给信息进行归类，若后代分离比为 9:7，则为9：(3：3：1)，即7是后三种合并的结果；若后代分离比为9：6：1，则为9：(3：3)：1；若后代分离比为15:1 则为(9：3：3)：1等。

表解基因的分离定律和自由组合定律的不同：

分离定律

自由组合定律

两对相对性状

n对相对性状

相对性状的对数

1对

2对

n对

等位基因及位置

1对等位基因位于1对同源染色体上

2对等位基因位于2对同源染色体上

n对等位基因位于n对同源染色体上

F1的配子

2种，比例相等

4种，比例相等

2n种，比例相等

F2的表现型及比例

2种，3:1

4种，9:3:3:1

2n种，（3:1）n

F2的基因型及比例

3种，1:2:1

9种，（1:2:1）2

3n种，（1:2:1）n

测交后代表现型及比例

2种，比例相等

4种，比例相等

2n种，比例相等

遗传实质

减数分裂时，等位基因随同源染色体的分离而分开，分别进入不同配子中

减数分裂时，在等位基因随同源染色体分开而分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合，进而进入同一配子中

实践应用

纯种鉴定及杂种自交纯合

将优良性状重组在一起

联系

在遗传中，分离定律和自由组合定律同时起作用：在减数分裂形成配子时，既有同源染色体上等位基因的分离，又有非同源染色体上非等位基因的自由组合

易错点拨：

1、F2共有16种组合方式，9种基因型，4种表现型，其中双显（黄圆）：一显一隐（黄皱）：一隐一显（绿圆）：双隐（绿皱）=9：3：3：1。F2中纯合子4种，即YYRR、YYrr、yyRR、yyrr，各占总数的 1/16；只有一对基因杂合的杂合子4种，即YyRR、Yyrr、 YYRr、VyRr，各占总数的2/16；两对基因都杂合的杂合子1种，即YyRr，占总数的4/16。

2、F2中双亲类型（Y_R_十yyrr）占10/16。重组类型占6/16(3/16Y_rr+3/16yyR_)。

3、 减数分裂时发生自由组合的是非同源染色体上的非等位基因，而不是所有的非等位基因。同源染色体上的非等位基因，则不遵循自由组合定律。

4、用分离定律解决自由组合问题

（1）基因原理分离定律是自由组合定律的基础。

（2）解题思路首先将自由组合定律问题转化为若干个分离定律问题。在独立遗传的情况下，有几对基因就可以分解为几个分离定律问题。如AaBb×Aabb可分解为：Aa× Aa，Bb×bb。然后，按分离定律进行逐一分析。最后，将获得的结果进行综合，得到正确答案。

知识拓展：

1、两对相对性状杂交试验中的有关结论

（1）两对相对性状由两对等位基因控制，且两对等位基因分别位于两对同源染色体。

（2）F1减数分裂产生配子时，等位基因一定分离，非等位基因（位于非同源染色体上的非等位基因）自

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