如何快速了解接触的质粒(四)

“ 会读质粒图才能用好质粒。 ”

前面部分稍微复杂一点的启动子和复制子已经大概介绍完了，后面会慢慢补充遗漏的小知识点，这一part是相对简单但是对于克隆筛选非常重要的----抗性基因。

       抗性基因是一段已知功能或已知序列的DNA片段，起到特异性标记的功能。使细菌对氨基苄青霉素，氯霉素等抗生素产生抗性，利用此来判断基因表达载体是否成功导入细胞内。

pUC19 质粒图谱

pcDNA 31(+)质粒图谱

上面质粒图谱中圈出的AmpR，NeoR/KanR等表示质粒中抗性筛选标签，方便后面筛选出阳性克隆(重组成功的阳性质粒；自连的假阳性质粒需要后续质粒测序验证)。抗性基因可以参考用来区分质粒的种类，像复制起点一样，质粒中有两个复制起点一般为穿梭质粒；类似的质粒中有两种抗性基因一般为穿梭质粒(pcDNA31(+))。

抗生素可以买粉末选择合适浓度和溶剂自己配制，也可以购买现成抗生素按照说明书上比例稀释直接使用即可。注意为了保证长期保存，常需要过022μm滤膜，避光；分装；-20°C冷冻保存。

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原核抗性

下面是常用于原核生物的抗生素

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真核抗性

新霉素(Neomycin)/G418

        新霉素是一种氨基糖苷类抗生素，能够结合到细菌核糖体 30S 和 50S 亚单位引起 蛋白错误编码，在蛋白合成期间抑制起始和延长，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均 有效，尤其是对金**葡萄球菌、白喉杆菌和炭疽杆菌作用更有效。与卡那霉素有完 全交叉抗药性，与链霉素有部分交叉抗药性。

        新霉素的使用浓度跟细胞培养方式、细胞种类、载体 DNA 有关。悬浮培养细胞更敏感，使用浓度低，贴壁细胞使用浓度高。硫酸新霉素工作浓度 范围为 100~1000 µg/ml。

    2 嘌呤霉素(Puromycin Dihydrochloride )

        Puromycin是来源于Streptomyces alboniger的一种氨基核苷类抗生素，中文名为嘌呤霉素，常用于筛选通过质粒转染/转化、病毒感染等方法能表达pac基因(puror)的真核或原核多克隆或单克隆细胞。Puromycin不仅用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。Puromycin的特点是快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。

    3 潮霉素B(Hygromycin B)

        Hygromycin B(潮霉素B)是来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的一种氨基糖苷类抗生素，对细菌，真菌和哺乳动物细胞均有抑制作用和细胞毒性。

        Hygromycin B(潮霉素B)通过干扰蛋白翻译过程中70S和80S核糖体易位，诱导对mRNA模板的错误翻译而抑制细胞蛋白质的正常合成，从而导致细胞死亡。

        大肠杆菌来源的Hygromycin B抗性基因(hyg或hph)所编码的Hygromycin B磷酸转移酶可将Hygromycin B磷酸化，导致其失去活性，从而起到解毒作用。因此，Hygromycin B可用于筛选成功转染了Hygromycin B抗性基因的原核或真核细胞。

    4 博莱霉素(Zeocin )

        Zeocin即phleomycin D1，中文名称博来霉素或者腐草霉素D1，是从轮状链霉菌(Streptomyces verticillus)的一个突变体菌株中分离而来的博来霉素/腐草霉素(bleomycin/phleomycin)的抗生素家族成员。它对细菌、真菌(包括酵母)、植物和哺乳动物细胞均有抑制作用和细胞毒性。

        Zeocin是一种碱性、水溶性的、铜离子螯合的糖肽抗生素。Cu2+螯合的Zeocin溶液呈现蓝色，无活性。当其进入细胞后，Zeocin上的Cu2+被还原为一价铜离子(Cu+)，并被细胞内的巯基化合物(sulfhydryl compound)清除，导致Zeocin被活化，能够结合到细胞内DNA上并使其断裂，最终导致细胞死亡。

        上面是原核生物和真核细胞中常用到的筛选抗生素，可以根据实验需要寻找合适的抗生素，这一部分就先讲到这里。

个人认为，看质粒图谱，

1，该质粒的用途：筛选，扩增，表达，还是报告？用一种低拷贝数的质粒来扩增目的片段显然不如高拷贝的质粒效率高；

2，质粒的宿主：原核质粒？酵母质粒？真核细胞质粒？

3，使用有无特殊要求：抗性，营养缺陷？

4，关键是研究：多克隆位点，上下游的限制酶位点是否合适，对于你要插入的目的片段，是否有高效、经济的酶切位点；启动子是什么诱导机制？起始密码子和终止子的位置？如果插入你的目的片段，是否会移码或提前终止？

5，如果你选用的是比较冷僻的限制酶，在多克隆位点外是否有该酶的酶切位点；

6

标签蛋白序列或报告基因序列在插入片段的上游还是下游？对后续实验有无影响？

祝好！

具体如下：

图谱中的ori表示质粒的复制起点。质粒的复制起点决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数相关，它是质粒中的一段特定序列，富含AT和重复序列。

图谱中的AmpR、KanaR等表示质粒载体中的筛选标签，多为抗生素抗性基因，方便后续通过抗生素筛选阳性克隆。特点是单词最后会以大写R或上标r结束。

图谱中的MCS或者许多内切酶排排坐的部分，就是质粒的多克隆位点。多克隆位点为一系列限制性内切酶酶切位点，是外源DNA的插入位点，一般可通过酶切/连接的方式将外源DNA插入质粒。

相关信息：

质粒载体中除复制起始位点、筛选标记、多克隆位点外，还具有其他一些表达或调控元件，如转录调控元件、翻译调控元件和融合表达标签蛋白等。

蛋白纯化标签蛋白：His-Tag，GST-tag等。

蛋白检测标签蛋白：Myc-Tag，Flag-Tag，HA-Taq等。

荧光蛋白表达标签：GFP，mCherry等。

对于测序图谱和质粒图谱来说，有很多不同之处。测序图谱是由测序仪器解码的，可以看出细节化信息，例如位点、变异、重复序列等；而质粒图谱是通过放大测序，可以体现出特定的DNA质粒中的变异情况。

没看过这文章，字面看意思如下：

Pak4，应该是p21-activated kinase 4的缩写，理解为“受p21活化的激酶 4”

pCMV-BD，是哺乳动物双杂交质粒的一方，BD指DNA binding domain，意思就是这个质粒带双杂交系统中DNA结合结构域的编码区，与之对应的是pCMV-AD, AD是指activation domain转录激活结构域。通俗讲，BD负责结合，AD负责激活，从而启动报告基因的转录。

GAL-Luc，应该是指GAL4-Luc，这应该似乎GAL4质粒系统中的报告基因。

mt，我估计是microtubule，微管，的缩写，这要结合文章来看，一般文章在首页都会有缩写词的备注。

纯属手打，欢迎，欢迎继续讨论，祝好！

质粒解剖

质粒四大要素：

一、复制起点：控制着质粒的复制，并决定了质粒的宿主和拷贝数；

Ori 是质粒的复制起点（也称 origin ), ori 和它所控制的组分一起称为一个复制子， ori 调控整个质粒在大肠杆菌中滚环式复制，使得质粒可以得到大量扩增

质粒中有两个 origin 的，为穿梭质粒，既可以在原核细胞复制，也可在真核细胞中复制。

二、筛选标记： 多为抗性基因，以便加以检测筛选；

只存在单抗性的质粒多为原核克隆载体

和原核表达载体。

而存在两种或以上的抗性的多为真核表达质粒，多为穿梭质粒

真核表达质粒不仅含 如AmpR ，还有如NeoR 筛选标记

三、多克隆位点： 外源基因的插入位点；

多克隆位点简称 MCS ，图谱中的 MCS 区

或者许多内切酶集中的部分，就是质粒的多克隆位点，它一般位于转录启动和转录终止信号之间

多克隆位点是外源 DNA 的插入位点，一般可通过酶切后连接的方式将外源 DNA 插入质粒

四、其他件：如转录调控元件、翻译表达元件和蛋白标签等

质粒中除了复制起始位点、筛选标记、多克隆位点外，还具有其他一些表达或调控元件，

如，转录调控元件（启动子），

翻译调控元件

融合表达标签蛋白等

能在宿主细胞中复制扩增，用于测序和保存外源基因。这类载体具有最简单的组成基本元件（ori，Ampr/Kanar,MCS）,没有启动子等启动转录、翻译的元件。

除克隆载体的基本元件外，还具有启动子等启动转录/翻译所必需的DNA序列。

用于靶向基因敲除和定点编辑。含有目标基因的识别序列或目标基因mRNA的shRNA，实现切断目标基因或mRNA降解，起到基因表达沉默的效果，下调蛋白表达。

Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。被宿主细胞复制因子所识别，利用宿主的复制机器，复制，增加拷贝数。因宿主复制机器不同，可分为原核/真核/穿梭质粒。

质粒转化是一个效率极低的过程，平均约10000个细胞中有1个细胞转化成功。想象一下，如果没有抗性基因的存在，筛选出阳性克隆的时间将大大延长。并且，外源性存在的质粒要进行复制等活动，会消耗宿主细胞自身的资源，在没有抗生素的培养基中，带有质粒的细胞不占优势，慢慢消失；在抗生素的存在情况下，抗性基因帮助宿主细胞分解抗生素，细胞才会需要质粒。

抗生素抗性基因 ：单词最后会以大写R或上标r结束。

Ampr 氨苄青霉素，水解 β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。

tetr 四环素，可以阻止四环素进入细胞。

camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶 使 G418（长那霉素衍生物）失活。

hygr 潮霉素，农杆菌里常用的。使潮霉素 β 失活

Kan（卡那霉素，常用）、Cmr（氯霉素，某些酵母表达质粒）、SM（链霉素）、

决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。商业化的质粒大多已人为地改造添加多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。

常见的标签如6×His、Myc、GST等；常用到的报告基因如β-半乳糖苷酶、GFP、荧光素酶等。

即启动子（Promoter）-核糖体结合位点（RBS）-转录终止信号-增强子。

这是用来区分克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些表达系统元件即成为表达载体。对于质粒发挥作用，至关重要！

启动子：是RNA聚合酶结合位点，位于基因表达框的上游。启动子序列控制RNA聚合酶与转录因子的结合，因此对于DNA何时何地转录至关重要。因宿主RNA聚合酶种类不同，质粒中的启动子类型也有所不同。P：这个一般是代表启动子。常见的启动子有：CMV、EF1（这俩是启动长片段的），H1、U6（启动短片段的，比如shRNA），35S、2×35S（做植物的应该懂的）。

核糖体结合位点：一般为AUG（起始密码子）。也常常会有SD序列，在起始密码子上游5-10bp处，同16s rRNA 3＇端互补。

Terms转录终止信号：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，下游有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。细菌表达质粒常见的终止子如T7，哺乳动物细胞质粒常见的终止子如SV40、SV40 late polyA、BGH等。加 poly（A）信号：可以起到稳定 mRNA 作用。pA：这个就是转录终止位点poly A。

增强子：为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。

参考链接： >

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