考马斯亮蓝测定蛋白质含量时应注意什么？

在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。

扩展资料：

注意事项：

测定时用同一种标准蛋白配制成覆盖待测样品蛋白浓度的标准蛋白溶液，然后加等量考马斯亮蓝G-250，混匀后用紫外分光光度计测定个标准蛋白样品的吸光值，并测定待测样品的吸光值，所有样品重复测三次。

最后以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算出回归方程，如Y=aX+b，让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度。

参考资料来源：百度百科-考马斯亮蓝法

1、去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH会对实验结果有影响

2、标准曲线有轻微的非线性

考马斯亮蓝测定蛋白质浓度是较常用的方法，误差可尽量减到最小，需注意：测定OD值前，将分光光度计提前预热至少30分钟，可保证准确性；配制好的考马斯亮蓝溶液应放于4度保存备用；盐离子不会影响实验结果，但去污剂，如TRITONX-100，SDS等，会严重干扰实验结果。

几种可能1.作标准曲线的时候，标准蛋白样品的浓度不准，或是加入试剂的量有偏差，结果标准曲线的零点吸光度都比你待测的高。2.每种蛋白定量法都有自己的试用范围，如果你的蛋白样品含去垢剂或盐浓度偏高，就会影响结果准确性。3.你的蛋白浓度太低，落到了标准曲线的线性范围之外。

首先所有使用玻璃器皿都要洗干净。1、考马斯亮蓝应在乙醇、磷酸介质中尽量溶解充分。然后过滤定容摇匀。2、用固定的2个比色杯做标准空白比色杯固定，每次测完后用乙醇将测定A值的比色杯洗干净。我测定的r值在0.9925到0.9986供你参考

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