如何验证引物的特异性

1、打开浏览器，输入进入NCBI网站

2、在此网页下方处找到Primer-BLAST，点击进入

3、点击进入以下界面，在Primer Parameters里面输入自己已经设计好的引物序列，在此以病毒DNA序列为例子进行阐述，该引物为扩增EB病毒（人类疱疹病毒4型）DNA一段序列的引物。

4、随后，在Primer Pair Specificity Checking Parameters里面的Databse中选择选项“Genome（chromosomes from all organisms）”，由于举的例子是扩增病毒DNA的引物，用于扩增患者是否携带该病毒，所以要避免该引物扩增出人体DNA中的片段，从而在下面“Organism”里面选择“Homo sapiens”

5、之后直接点击页眉左下角的“Get Primers”按钮进行引物特异性的验证，点击后的页面如图所示。

6、大概稍等一会儿，就会得到结果，结果页面如下图。本条引物在扩增时可能会出现两天杂带，但是该段引物序列与人基因组序列还是存在碱基的不一致，所以也可能扩增不出来，另外产物的片段大小与目的片段大小差异较大，故本对引物的特异性很好!

BBQ 机制介绍： >

用BLAST程序查出的序列，不知道你要查的是什么序列，氨基酸或者是核酸序列，要看一下5个关于BLAST的选项对号入座。至于想查相似度差一些的序列，将你的目的序列输入后，基本所有的同源序列都出来了，相似度为60%~70%的也应该有的。可能是你在选择种属时出错了。

BLAST（是一种用于在数据库当寻找任何蛋白质或者基因序列与你的目标序列一致的程序），

S值表示两序列的同源性，分值越高表明它们之间相似的程度越大。

E值就是S值可靠性的评价。它表明在随机的情况下，其它序列与目标序列相似度要大于这条显示的序列的可能性。所以它的分值越低越好。

MEGABLAST常被用于鉴定核酸序列MEGABLASTisthetoolofchoicetoidentifyanucleotidesequenceMegaBLAST也是一种BLASTN程序。

MegaBlast是经典比对软件Blast的一个子模块，在现版本的Blast+中隶属于blastn的一个子模块（task）。blastn是用于核酸序列比对的一个模块，MegaBlast执行同样的功能，但是它可以跑得更快。

MegaBlast使用的database依然是正常的，用makeblastdb建立的database文件，但是我们还可以对database再建立一个MegaBlast专用的index。

双向Blast不是两个Blast过程的简单组合,它分为三个步骤。

第—个步骤是正向Blast,其过程和常规的Blast—样,由query_l得到subject_l;

第二个步骤是反向Blast,将之前正向Blast得到的subject_l作为反向Blast的query,即query_2,再执行Blast程序,得到subject_2;

第三步是筛选,将subject_2排序后,按照query_2进行分块,然后将对应的query—1的名称和每个query_2块中最佳匹配的subject_2的名称进行比较。如果这个最佳的subject_2和对应的query—1完全一样,便将与这个subject一2对应的query一2纪录,这个query_2便是我们需要的结果。

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