GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？

GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。

生物帮上面有详细的介绍， http://www.bio1000.com/reseach/immunology/ 免疫学科研进展,免疫系统,免疫防御,免疫检测,医学免疫学,营养免疫学,免疫学的应用。

1、细胞系的选择

并非所有的肿瘤细胞都可以成瘤。在正式做实验之前，建议去查查ATCC上面的测试数据。比如看看下面红框处。但是，ATCC这方面的数据很缺，所以第二条途径是去查文献。但建议查多篇文献。

如果不得不用不能独立成瘤或者难以成瘤的细胞系，请看第3点选NOD SCID小鼠，以及第4点的Matrigel法。

2、细胞数要多少

这一点，很难有个标准参考值。像我试过一个很猛的大鼠胶质瘤C6，就算只要10^4甚至更低细胞数都能长。不过，多数细胞系会落在10^5 - 10^6之间。有时候，低了不一定说不会长，而是长得慢。高了也不一定好，长太快，肿瘤内部的血管形成不良，容易坏死，而且做药物腹腔、静脉注射的话，也不容易充分运输到肿瘤灶部。

基本上可以有这么一个经验：注射的细胞量，可以让肿瘤在3-6周可以长到可以解剖的大小即可。快了不一定好，慢了浪费时间。

3、小鼠的选择

基本上，大家都是选BALB/c Nude这种胸腺缺陷的裸鼠，已经可以满足绝大多数实验了。对于一些对免疫比较敏感的肿瘤，可以选择NOD SCID。不过NOD SCID是长毛的，对于一些特殊的肿瘤注射或者手术，需要备皮。

一般而言，4-6周龄的小鼠即可注射肿瘤。

4、细胞怎么处理

从细胞房出发，到动物房之间，肯定需要很长的时间。细胞离开培养环境的时间一长，活性就会降低，导致实验失败。

这里我推荐，通过洗涤、消化、离心的方法，获得细胞沉淀后，要将其重悬在一个能够保持细胞活力的buffer。这个buffer的成分是：1X 无Ca2+、Mg2+的HBSS中，加入终浓度为10-15 mM的HEPES，以及1X的GlutaMAX。注意，请不要加入血清。

细胞的浓度，应该调整为每一针100-200 ul的量。比如，你要注射的细胞量是10^6一只，那就把细胞悬液的浓度调整为每100-200 ul的体积含有10^6个细胞。有的细胞很难达到高浓度，这时候就需要增大重悬体积。个人建议，最好不要超过300 ul一针，否则注射的时候很容易漏出来。

细胞重悬之后，插到冰上备用。

有些细胞即使用了NOD SCID也很难成瘤甚至成不了瘤，这时可以试试Matrigel法，为肿瘤细胞提供了一个生长支架。

一般地，我们使用低生长因子（Growth factor reduced）无酚红Matrigel，大概的蛋白质浓度会在10 mg/ml左右。Matrigel最终会和细胞悬液1：1混合后注射。

注意两点：

1、温度一高，Matrigel就会凝固，因此使用时应该在冰上 *** 作。在加入细胞悬液前，悬液也应该插到冰上降温。或者可以用另外一个办法，即先用上述的缓冲液1：1稀释Matrigel，再用来重悬细胞沉淀。含有Matrigel的细胞悬液，也应该始终插在冰上。

2、同样由于温度的问题，在注射时，应该注射一只吸一份悬液。此外多准备几根注射器，万一凝了堵了赶快换。

5、注射的方法

为了降低动物的痛苦，我会使用吸入式麻醉剂isoflurane（异氟醚）给小鼠进行浅麻醉，再注射。下图就是麻醉设备：右方是灌入isoflurane的设备，利用麻醉剂的挥发性，通过调整气压阀，将麻醉气体泵入左边的密封盒子里面。一般5分钟内，小鼠就能被麻倒，并可以保持约10-15分钟的麻醉时间。

当然，不麻醉也可以直接注射（在不违规的情况下）。但从动物福利的角度出发，以及方便实验人员而言，麻醉比不麻醉好。目前我所在的单位，皮下移植瘤实验的标准protocol都是要吸入麻醉的。但国内这一点做得还不是很好，没有统一的机构在管理。

注意，请合理使用麻醉剂。对于皮下注射来说，isoflurane吸入性麻醉已经足够了，危险性也比较低（在美国列为管制药品schedule VI类，或者说不算经典的管制药物）。完全不需要使用注射性麻醉剂比如Ketamine/Xylazine（氯胺酮/甲苯噻嗪），这种属于管制药品了，不涉及大手术的不要用。其他注射类如苯巴比妥也不要用，可能会对肿瘤细胞的活性有影响。

如果没有isoflurane挥发机，可以自己做一个简易的装置。如下图，在一个密封的罐中，置入含有isoflurane稀释液的棉花，并把实验动物放进去即可。麻醉剂的剂量，是通过isoflurane比密封罐体积来换算的。

小鼠麻倒后，先用打孔器在耳朵上做标记（0/0，1/0，0/1，1/1，共计4种标记方式）。随后，一手用钝头的镊子轻轻拎起注射部位的皮肤，不要扯到肌肉，一手拿着注射器（一般都用那种小的胰岛素注射器）刺入皮肤，注射细胞悬液。在注射的过程中，你可以明显看到皮肤下方鼓起一个小包。注射完毕后，留针数秒再拔，不要马上拔出来，以免细胞悬液漏出来。

如果没有麻醉，那就只能靠手抓鼠了。如果你是右利手，那么用左手食指和拇指夹住小鼠颈部皮肤，将尾巴夹在小指和无名指之间，这样左手一翻，小鼠的侧面就暴露出来了。然后右手持针，贴着皮肤（目测都要和皮肤保持10-20度夹角了）进针。注意当针已刺入时，保持针头略微上挑的状态，以免刺入肌肉。值得注意的是，小鼠会挣扎，所以手要稳。（所以说啊，麻醉再注射多么方便）

一般而言，如果注射量仅有100-200 ul，这种 *** 作手法不会出什么意外。但如果注射量大，就比较麻烦了。不过按照我师姐的说法是，可以在刺入皮肤后，继续往下进针刺入浅层肌肉，再上挑回到皮下，开始注射。这样子，大体积的细胞悬液就不容易漏出来。但是这种方法有个缺点是，肿瘤容易往肌肉深处长，到时候测量体积就不准了。因此，注射量应该尽可能小。

注射完毕后，将小鼠放回笼中，并观察小鼠的活力。待小鼠完全苏醒，即可离开动物房。

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