求助PMSF 缓冲液使用量

pmsf遇水分解，要先用异丙醇配好，用的时候再加入到体系里。而且PMSF的活性只能保持几个小时，如果你做长时间的分离，要做补充。一般配成10mM的，使用的时候，100ul加10ul。（仅供参考）

你的问题我没学过，以下是我在网上找的，希望对你有用！

细胞内蛋白质的提取：

1、trixon-100或np-40裂解液裂解；

2、冻融裂解法；

3、研磨法；

“经典的就是分子克隆2讲的，用ripa裂解，然后刮下来，冰裕30min，超生，4度离心10min”

（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的pbs（0.01m ph7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上 *** 作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将pbs弃净后把培养瓶置于冰上。

3、按1ml裂解液加10 μl pmsf（100mm），摇匀置于冰上。（pmsf要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

4、每瓶细胞加400 μ含pmsf的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用q将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个 *** 作尽量在冰上进行。）

6、于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）

7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。

（2） 组织中总蛋白的提取：

1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2、加400 μl单去污剂裂解液裂（含pmsf）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。

3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4、裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一） *** 作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。

2、弃上清，加入4ml pbs并用q轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用pbs重复洗涤一次。

3、用q洗干上清后，加100 μl裂解液（含pmsf）冰上裂解30min，裂解过程中要经常d一d以使细胞充分裂解。

4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（二）蛋白含量的测定

（1） 制作标准曲线

1、从－20℃取出1mg

加PMSF是因为PMSF是一种蛋白酶抑制剂，可以有效的抑制菌体裂解后的释放出的丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的活性。防止它们降解消化目标蛋白。需注意PMSF溶解于水溶液后自身会迅速降解，大约1小时会自身降解完毕即失去作用。需要每1小时补加一些新鲜的PMSF。

加DTT是因为DTT是一种还原剂，可以打开蛋白质的二硫键，阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。避免His-tag被包裹在蛋白结构的内部导致目标蛋白不能结合镍柱。需注意DTT会还原镍柱上的镍离子，可能会造成镍离子的脱落而影响柱效。

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