RNA pull down 原理与 *** 作步骤

    RNA pull-down其目的是检测与RNA互作的蛋白。实验过程简单来说就是把感兴趣的RNA进行体外转录，并标记（如生物素标记），再与细胞裂解液共同孵育，形成RNA-蛋白质复合物，然后将分离得到蛋白质，通过WB 或 质谱进行验证或鉴定。

实验步骤：

l体外转录模板制备

1.设计扩增目的基因的引物，并带上T7 promoter序列的如下表（表中红色部分序列为T7 promoter序列）：

基因名称引物名称引物序列

GAPDH-SenseFaaaaTAATACGACTCACTATAGGGTGTTGCCATCAATGACCCCTT

RCTCCACGACGTACTCAGCG

GAPDH-AntisenseFTGTTGCCATCAATGACCCCTT

RaaaaTAATACGACTCACTATAGGGCTCCACGACGTACTCAGCG

2.构建目的基因载体，并用带T7 promoter序列的引物扩增，进行琼脂糖凝胶回收。回收产物用作体外转录模板。

l体外转录&生物素标记RNA

1、取一支无RNA酶的EP管，按如下表加入转录体系，37℃孵育35min。

DNA模板 1ug

Biotin RNA Labeling mix 2µl

10 ×Transcription  buffer 2µl

T7 RNA Polymerase

RNase  Inhibitor

0.5µl

1µl(40U)

                             补足RNase-free水至20µl

2、取出孵育好的EP管，加入1µl的DNaseⅠ，37℃孵育15min，除去DNA模板。(取出上述 *** 作的EP管，加入2µl0.2M EDTA（pH=8.0）终止反应。

3、加入180ul RNase free 水，并 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1),涡旋混匀 。

4、12000 转，4℃离心10min

5、转移上层水相到新的离心管，加入0.1V的3M醋酸钠（PH:5.2）2.2V的无水乙醇，6uL糖原；颠倒混匀后，-20℃沉淀过夜；

6、12000 转，4℃离心10min并用500uL70%乙醇洗涤沉淀；

7、室温静置2~5min，晾干乙醇后加入30ul的DEPC处理水溶解RNA，并用超微量紫外分光光度计测定RNA浓度。

8、取3µg Biotin标记的RNA（补充水至：25ul），95℃加热2min，立刻冰浴2min加入25ul Structure Buffer，室温静置20min。

l样本前处理：

1.用1ml 4℃预冷的RLN 悬浮细胞（加入 RNase inhibitor 及蛋白酶抑制剂 ）冰上孵育5 min

2. 1450 × g, 4  ℃, 离心2  min ，去上清；

3.用100ul　预冷的RLN洗涤1次（不能悬浮沉淀）；

4.用170ul预冷的　protein lysis buffer　重复悬浮细胞（超声10s停10s；6次）；然后涡旋30s，并吹打混匀；

5.冰上孵育30 min

6. 17000 ×g, 4 ℃，离心15  min ；取150ul上清，-80℃冻存备用。

lDynabead™ MyOne™ 链霉素亲和素 C1处理步骤：

1.涡旋震荡磁珠40s，混匀磁珠

2.分装50ul磁珠的1.5mL离心管中；

3.磁力架上放置1min，弃上清；

4.用1mL的Solution A洗涤磁珠两次，每次2min

5.用等体积的Solution B 洗涤磁珠一次

6.20 mM Tris (pH 7.5)　洗涤两遍

7.加入50 μL RNA capture buffer　重悬磁珠

8.加入50 pmol生物素标记RNA（3ug）室温颠倒孵育 15 min

9.磁力架上放置3min,去上清

10.用50 μL of 20 mM Tris(pH 7.5)洗涤两遍；

11. 用100 μL of 1× protein–RNA binding buffer洗涤1次；

l  RNA PULL DOWN

1.配制protein master mix:150ul上清，加入30ul丙三醇，20ul 10x protein–RNA binding buffer

8.分装100ul　protein master mix到RNA－磁珠复合物中；4℃翻转孵育1h；

9.磁力架上放置1min，弃上清；

10.1X wash buffer (100µL)，洗涤3次

11.加100ul elution buffer 悬浮磁珠。

12.加入25ul 5×蛋白鉴定loading buffer沸水煮10min。

13.银染检测pull down 效果；然后进行WB验证或质谱鉴定

PS:如期生物在RNA pull down 项目具有丰富的经验，从初始探针制备至后期质谱鉴定或WB验证全程皆由如期生物老练的技术员完成；质量有保证，周期快。如期人从不设技术壁垒：有项目外包给我们固然欣喜，单纯技术的交流也是欢迎的。同一个实验，不同实验室都会有自己优化的一套方案：想了解我们的详细要点，私信我们即可，如期人知无不言；对我们的方案有更好的优化建议，也请私信我们哈，如期人乐于一起探讨，一起进步。

T7是启动子（T7 promoter），是来自于T7噬菌体的能够对T7RNA聚合酶有特异性反应的强启动子，是启动T7噬菌体基因转录的一段序列。

T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。T7 RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其合成mRNA的速度比普通大肠杆菌的RNA聚合酶快5倍左右。

启动子特异性

除了基于转录RNA的类型选择启动子外，还需要确保质粒上的启动子能在使用的宿主细胞中工作。因为不同细胞类型和组织中的转录机器不同，相应的启动子也不同。细菌的启动子只能在原核细胞中或者只能在同种菌或亲缘关系较近的菌株中工作。同样地，各种类型的真核细胞（哺乳动物，酵母、植物等）需要独一无二的启动子，并且很少有交叉。一般来说，相比真核细胞启动子，细菌中启动子的多样性和复杂度更低。

启动子不同，基因的表达状态可能也不同，一些启动子能一直保持活性状态，而另外一些会受到更严格的调控。受调控的启动子可能只在特定的组织或生长阶段起作用，启动子的开关可能还会受到诸如化学物质、环境温度、光照条件等环境因素的影响。

在细胞中，启动子受到很多其它调控因子的控制，如增强子、绝缘子和沉默子等，然而，有时也会发生一些错误的转录，这对细菌来说不算什么大事，但是会影响实验的结果，甚至如果你的目的基因表达有毒产物，则可能会杀死细胞。

为了避免这种情况发生，科学家创造了合成启动子，并且通常会融合一些其它的启动子元件，以便启动子能够被更严格地调控。