关于荧光分析介绍

[拼音]：yingguang fenxi

[外文]：fluorescence analysis

利用某些物质受光照射时所发生的荧光的特性和强度，进行物质的定性分析或定量分析的方法。

简史

早在1575年，就有人在阳光下观察到菲律宾紫檀木切片的黄色水溶液呈现极为可爱的天蓝色。1852年G. G. 斯托克斯用分光计观察奎宁和叶绿素溶液时，发现它们所发出的光的波长比入射光的波长稍长，由此判明这种现象是由于这些物质吸收了光能并重新发出不同波长的光线，而不是由于光的漫射作用引起的。斯托克斯称这种光为荧光。这一名词由发生荧光的矿物萤石(fluorite)衍生而来。20世纪50年代前使用滤片式荧光计，只能测量荧光的总光度值。1955年制成第一台荧光光度计。60年代开始了真实荧光光谱、荧光效率和荧光寿命的测量。70年代引进了计算机技术、电视技术、激光技术、显微镜技术。80年代，荧光分光光度计大多配有微型计算机－数据处理器，能对荧光光度值进行积分、微分、除法、减法和平均等运算。

原理

大多数分子在室温时均处在电子基态的最低振动能级，当物质分子吸收了与它所具有的特征频率相一致的光子时，由原来的能级跃迁至第一电子激发态或第二电子激发态中各个不同振动能级（图1a、图b ）。

其后，大多数分子常迅速降落至第一电子激发态的最低振动能级，在这一过程中它们和周围的同类分子或其他分子撞击而消耗了能量，因而不发射光（图1c）。分子在第一电子激发态的最低振动能级停留约10-9秒之后，直接下降至电子基态的各个不同振动能级，此时以光的形式释放出多余的能量，所发生的光即是荧光(图1d)。某些荧光物质分子在降落到第一电子激发态的最低振动能级后，通过另一次无辐射跃迁降落至亚稳的三重线态，又受到热激活作用再回到第一电子激发态的各个振动能级，最后由第一电子激发态的最低振动能级降落至电子基态而发出荧光。这种荧光因受激发光至发生荧光的时间较长，故称为迟滞荧光（图1e、g、h）。

产生荧光的第一个必要条件是该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构；第二个条件是该分子必须具有一定程度的荧光效率。所谓荧光效率是荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光的量子数的比值。

使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发生的荧光通过发射单色器照射于检测器上，调节发射单色器至各种不同波长处，由检测器测出相应的荧光强度，然后以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，所绘制的图即为荧光激发光谱，又称激发光谱。

紫外－可见光区荧光的产生，是由第一电子激发态的最低振动能级跃迁至电子基态的各个不同振动能级所致，而与荧光物质分子被激发至哪一个能级无关。因此，荧光光谱的形状与激发光的波长无关。

物质的吸收光谱的第一吸收带的形状，决定于第一激发态的各个振动能级的分布情况。跃迁的两个能级之间的差距越大，吸收峰波长越短。荧光光谱的形状决定于电子基态振动能级的分布情况。电子基态的振动能级越高，两个能级之间的差距越小，则荧光峰的波长越长。电子基态和第一电子激发态中能级的分布情况是相类似的，所以，荧光光谱和吸收光谱的形状相似，但却呈镜像对称关系。

溶液的荧光强度与该溶液的吸光强度及荧光物质的荧光效率有关。对于某一荧光物质的稀溶液而言，每一平方厘米的截面上的荧光强度F可用下式表示：

式中φ为荧光物质的荧光效率;I0为每秒钟每平方厘米上入射光的强度；ε为荧光物质的摩尔吸光系数；c为荧光物质的浓度；l为样品池的厚度。由上式可见，在入射光强度与液池厚度不变的条件下，某一荧光物质的稀溶液(εcl≤0.05)的荧光强度与该物质的浓度成正比。

溶液的荧光强度还受到溶剂、溶液温度和pH值的影响。溶液的荧光强度还会因荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用而降低，这种现象称为荧光猝灭。

仪器

进行荧光分析的仪器称为荧光分光光度计。它由以下五部分组成。

荧光分光光度计多采用氙灯作为光源，因它具有从短波紫外线到近红外线的基本上连续的光谱，以及性能稳定、寿命长等优点。近年来激光荧光分析应用日广，它采用激光器作为光源，有氮激光器、氩离子激光器、可调谐染料激光器和半导体激光器等。染料激光器有连续波和脉冲两大类。

是从复合光色散出窄波带宽度光束的装置，由狭缝、镜子和色散元件组成。色散元件包括棱镜和光栅。荧光分光光度计有两个单色器：激发单色器和发射单色器。绘制三维荧光光谱（图4 ）

时则采用正交多色器。所谓多色器系单色器去掉出射狭缝，正交指两个多色器的入射狭缝互成空间垂直。

也称样品池，通常用石英或合成石英制成，玻璃容器因会吸收波长323纳米以下的射线，不适用于 323纳米以下的荧光分析。对于溶液试样的荧光分析，光源、试样容器和探测器通常排成直角形，对于不透明的固体试样，则排成锐角形。

通常采用光电倍增管作为检测器，灵敏度较高。三维荧光技术则用硅靶增强光导摄象管作检测器。

有表头显示、数字显示和记录器等。近年来荧光分光光度计大多配有微处理机，其信号经处理后在荧光屏上显示，并输给记录器记录。某些型号的荧光分光光度计，按下电键即可得出三维荧光光谱。

荧光分光光度计可分为单光束与双光束两种。在单光束荧光分光光度计中，光源发出的光经激发单色器单色化的光只有一束，照射在样品池上，样品发出的荧光经过发射单色器色散后照射在光电倍增管上（图2 ），然后用光度表进行测量。

双光束荧光分光光度计经过激发单色器色散的单色光由旋转镜分为两束，在不同瞬间分别将光会聚于样品池和参比池上。样品溶液和参比溶液发出的荧光进入发射单色器，然后照射在检测器上（图3）。

应用

在紫外线照射下能发生荧光的无机物很少，但许多元素与有机试剂所组成的络合物，在紫外线照射下会发生荧光，由其荧光强度和标准曲线可以测定该元素的含量。现在借助于有机试剂进行荧光分析的元素已达60余种。至于非金属元素（如氟、氯、溴、碘、硫等）或过渡金属元素（如铜、铁、钴、镍、汞等）则可用荧光猝灭法进行测定。

荧光分析法的灵敏度很高，一般为微克／升，较紫外-可见分光光度法高二、三个数量级，与原子吸收光谱法相近。如采用激光时间分辨荧光法，灵敏度还可大大提高。例如，测定海水中铀的检出限可达0.04微克/升，测定铕的检出限可达2皮克／升。

芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，易于吸光，其中庞大而结构复杂的化合物在紫外线照射下都能发生荧光。如采用溶剂萃取、色谱法、电泳等方法预先加以分离而后进行荧光分析，常可测定它们在试样中的低微含量。荧光分析与高效液相色谱法密切结合，已成为该法的检测工具。

荧光激发光谱和荧光光谱可作为定性分析的一种手段，用以鉴定有机络合物。根据试样的图谱和峰波长与已知样品进行比较，可以鉴别试样和标准样品是否同一物质。对于复杂混合物中的同分异构体，室温荧光光谱的波带太宽，难于鉴别，但如冷却至77开的低温，可获得高度分辨的荧光光谱，足以检测复杂混合物中的个别分子。此法曾用于原油中各种三环杂氮化合物的鉴别。近年来还采用同步扫描荧光法及1～4级的导数荧光光谱来鉴别多组分荧光物质。

光离解反应常生成自由基，但自由基存在的时间很短，难于鉴定。随着激光荧光法的发展，建立起皮秒脉冲激光荧光法，可用于卤素芳族化合物的光离解反应的研究并用以鉴别所生成的自由基。在某一波长的皮秒激光脉冲的激发诱导下，卤素芳族化合物发生光离解反应，C-X键分裂而生成自由基，用较第一种激光脉冲延迟数十皮秒的另一波长的皮秒激光脉冲进行激发，并绘制荧光光谱，可以对这些自由基进行鉴定。

进展

70年代以来，荧光分析法在仪器、方法、试剂等方面的发展都非常迅速。激光荧光法的建立使荧光分析又有进一步的提高。激光具有下列特征：

（1）光子通量大，峰值功率高；

（2）空间相干性好，可将光束精确定位于小范围内；

（3）时间相干性好，可得皮秒短脉冲，使检测系统将激发信号和发射信号分开；

（4）谱线窄且波长可调。由于激光可聚焦成很小的光斑，使用不到1微升的试样便可进行荧光分析，这极有利于生物化学的研究工作。例如，采用氮激光器的激光荧光法测出红血球中铁的平均含量为10-13克，单个精子中锌的含量为10-15克。采用脉冲染料激光器配用盒式积分器处理的延迟线，可建立纳秒的时间分辨激光荧光法，它具有在时间和波长尺度上分辨不同组分的能力；与高效液相色谱法相配合，可用于湖水中及空气悬浮颗粒物中致癌物质多环芳烃的检测。对于苯并[a]芘的检测限可达0.2皮克。采用Nd3+－钇铝石榴石固态振荡器或同步泵浦染料激光体系，可得到皮秒激光脉冲，曾用于有机分子的振动张弛、光分解反应、双核金属络合物内电子转移等项研究。70年代曾提出同步激发技术，从而得到同步激发荧光光谱。此后又将同步激发与导数光谱两种技术结合起来，大大提高了多组分混合物荧光分析的选择性，成为多组分混合物定性及定量分析的有效手段之一。

三维荧光光谱能获得激发波长和荧光发射波长同时变化的荧光光度信息。它的三种空间坐标分别表示发射波长、激发波长和荧光强度(图4 )。这种技术可用于多组分混合物的定性和定量分析，例如船舶污水的分析和多环芳烃混合物的分析等；还可用于多组分光化学反应动力学过程的研究。

除上述各种方法外，利用荧光偏振、能量传送或荧光寿命的荧光免疫分析也已取得广泛的应用。