关于细胞化学介绍

细胞化学的染色法

染料可以是碱性的(如亚甲蓝)或酸性的(如依红)。酸性染料的生色基团是硝基(-NO2)和醌基；碱性染料的生色基团，包括着偶氮基(-N＝N-)胺基〔或吲达胺基(-N＝)〕。染色的原理是基于在酸性染料中具有染色作用的阴离子和细胞内的碱性物质相结合，而碱性染料中的阳离子和细胞内的酸性物质相结合，所以酸性的细胞成分被碱性染料所染色，而碱性的细胞组分则被酸性染料染色。例如显示蛋白质所用的米氏反应，其中硝基汞试剂作用于细胞中蛋白质侧链上的酪氨酸基，形成红色沉淀，在重氮基反应中氢氧化重氮与酪氨酸、色氨酸和组氨酸基反应形成有颜色的复合物。某些碳水化合物、酯类和 DNA可用对其醛基有特异结合的试剂，如雪夫氏试剂显示之。染核酸的方法与核苷酸磷酸、碳水化合物和嘌呤及嘧啶的三种成分的特性有关。DNA和RNA能吸收 260纳米波长的紫外光是由于氮基的存在。DNA 分子内的去氧戍糖与孚尔根氏反应有关。DNA及RNA的嗜碱性又与其分子中磷酸根有关，因此，碱性染料如天青能与DNA及RNA产生特异性反应，甲基绿染DNA也是由于磷酸根的存在。

显微细胞化学方法多是把单层的培养细胞，或把恒冷箱制备的新鲜而又薄的冰冻切片放在一定溶液内温育，使待测的物质或酶与染料或试剂发生专一性的反应，要求在原位上直接形成或变为不溶解的产物。有颜色的产物用光学显微镜，荧光产物则用荧光显微镜，吸收紫外光的物质用石英或反射显微镜，观察其在细胞结构上的分布。高电子密度产物可在电子显微镜下观察。

一般是将薄的冰冻切片用适宜的底物温育，来测定酶在细胞内的位置。

组织化学家格莫里在测定碱性磷酸酶时是用甘油磷酸钠为底物，酶水解释放的磷酸根与底物溶液中的某些离子结合产生非溶性的金属盐，后又转变成金属铅，硫化铅，硫化钴及其他有色的化合物而得以显示出来；另一种方法是用β-萘酚的磷酯作为底物，酶水解释放出的β-萘酚，在有重氮盐存在时立即结合，因而在酶活动位置产生有颜色的偶氮化合物，其他水解酶，例如脂酶、酸性磷酸酶、硫酸脂酶和β-葡萄糖苷酶，也是根据这种原理，改变一些条件和相应的底物以显示之。

氧化酶能催化供体的电子转移到氧原子上，它们有的含铁，如过氧化物酶和过氧化氢酶，有的含铜，如酪氨酸酶和多酚氧化酶。可用无色的底物，如联苯胺来验测过氧化物酶，在酶存在处由于过氧化氢的作用，这些底物会转变为可染色的染料，联苯胺反应是由于过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色或棕色的产物，细胞色素氧化酶能氧化纳笛氏试剂中α-萘酚和二甲基对苯二胺氧化成靛酚蓝染料。3′，3′-二氨基联苯胺试剂可用来在电子显微镜下研究过氧化物酶和细胞色素氧化酶。

脱氢酶能从底物中将电子转移到氧化试剂上或电子体上。四唑盐为受氢体在反应中由脱氢酶将底物氢原子转移到四唑盐而形成有色的甲(formazan)在局部沉淀，显微镜下可判明该酶的定位。四唑盐种类甚多，最常用的是硝基蓝四唑盐（简称(Nitro BT)，Nitro BT类染料显示何种脱氢酶，则由所用底物而定，如用琥珀酸钠，甲是琥珀酸脱氢酶作用下的产物，用乳酸钠或苹果酸钠则是乳酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶作用的结果。但有些脱氢酶须有辅酶Ⅰ(NAD+)或辅酶Ⅱ(NADP+) 才能发生作用，显示这种脱氢酶时须另加所需的辅酶，辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ或黄素蛋白(FAD或FMN)可做为氢接受体，当NAD+和NADP+接受脱氢酶释放的氢时，它们即成为还原NAD(即NADH)和还原NADP(即NADPH) (见图)。

物理技术的细胞化学

利用物理学技术研究各种细胞组分。

其原理是利用某些细胞组分吸收紫外光的不同特点，如核酸吸收光波是260纳米，蛋白质是280纳米，有些染色反应产物也有对可见光谱的特异吸收能力，用细胞光度计进行定量分析（见表）。

核酸有特异的紫外光吸收能力是因为它有嘌呤和嘧啶基，因此，DNA、RNA和核苷酸吸收能力相同。孚尔根氏反应只显示 DNA的存在，适合于定量测定在切片中的DNA。米氏反应可用来测定蛋白含量。

可用以检测细胞的自发荧光和与荧光染料结合后的荧光。有些化合物受到紫外光照射时，能吸收辐照，并发出可见光，称自发荧光。有些化合物或细胞组织的成分，本身不发荧光，但能有选择的吸收不同的荧光性物质(荧光染料)，因而也能发荧光称次级荧光；这种显示方法称荧光染色法。利用自发荧光或吸收荧光素来鉴定细胞组织的物质，如维生素、类脂质、色素、致癌物，一些其他偶氮染料，奎宁、磺胺类、青霉素等药品，铀及其他金属衍化物等已日见重要，特别是肿瘤细胞的鉴定及抗体抗原的显示。荧光鉴定的一个重要进展是发现用副甲醛固定冰冻干燥的组织与儿茶酚胺和吲哚胺产生泠凝作用，可相应地发散绿色和黄光荧光。利用此种荧光反应结合显微分光摄像法已对交感神经节中小强荧光(SIF)细胞内儿茶酚胺的性质进行了研究。

用标记的抗体测定细胞内的抗原。应用此种技术能在光学和电子显微镜水平下找出抗原的位置。一般常用的是A.H.孔斯氏技术，抗体用荧光异氰酸盐偶联的抗体。直接显示法主要步骤是先将组织骤冷，制成薄的切片，然后用偶联的抗血清染色。常用的是间接显示法，其原理是用荧光染料或一种酶标记的第二抗体来加强第一抗原-抗体反应。常用的是过氧化物酶，它在有啹O2存在时与DAB(3′，3′-diaminobenzidin)相反应，产物是电子密度大的沉积物，用光学显微镜和电子显微镜均可检测。

在免疫电镜细胞化学的研究中，1974年I.W.麦克莱恩和P.K.纳卡内曾发现应用副甲醛混合液能使细胞内抗原更为稳定。1976年文德尔沙弗 -克拉布等发现用未标记抗体酶方法研究病毒的抗原的超微结构定位要比应用铁蛋白标记抗体要成功的多，同时发现将组织块切成薄片后包埋、温育、染色，比将组织块包埋前温育、染色为优。

这种方法在细胞生物学中日益显示出重要性，许多细胞骨架蛋白，例如微管蛋白、肌动蛋白、调钙蛋白等均可用免疫细胞化学原理找到它们在细胞内的位置，随着生化提纯的蛋白质的加多，免疫细胞化学还会得到更广泛的应用。

如孚尔根氏反应及甲基绿（焦宁或派罗宁）染色表明 DNA只存在于染色质及染色体内，核仁主要是RNA。孚尔根氏反应是用雪夫氏试剂（亚硫酸品红）来染稀盐酸水解后的 DNA使之成为紫红色沉淀，因为这一反应结果较为稳定，所以在用细胞光度计测定染色切片上细胞核的 DNA含量时多用此法着色，并从色的深浅来计算含量，进一步又采用棓花青染色来测细胞质的 RNA，1899年A.帕彭海因用甲基绿焦宁G染色法，对细胞内DNA及RNA染色，使DNA染成绿色，RNA染成红色。吖啶橙是专染核酸的荧光素，RNA多呈红色荧光，次为黄色，最弱的呈绿色。因为肿瘤细胞一般含有较多的RNA，曾做为鉴定肿瘤细胞的一种方法。在超薄切片上染DNA及RNA也发展了多种染色技术，常规应用溴酸氨络合物，其反应可能是一种类似孚尔根氏的反应。染色后DNA出现特异性着色，对比鲜明，此技术可显示病毒感染的细胞核内30埃的病毒DNA细丝。

核的蛋白质定量测定多应用萘酚黄 S及二硝基氟苯染色法。此法定量可靠，假若将萘酚黄 S与孚尔根氏反应结合在一起应用，则蛋白质与DNA的着色，就互不影响。有的学者应用这种技术研究核内非组蛋白蛋白质。指出核内非组蛋白蛋白质系由基因调节蛋白质所组成。因此，对其定量研究日趋重视。在转录活动有重大改变时，常伴随着此种蛋白质的增加，如用这种联合染色方法对此种蛋白质进行定量测定，可证明生长旺盛的细胞中非组蛋白蛋白质与DNA的比率较静止期细胞为高。

用副品红孚尔根氏反应可对 DNA与蛋白质同时染色和测定，再用吖啶黄-茚三酮染色，然后除去非特异性荧光，即可在同一个细胞上同时测定蛋白质及 DNA的含量，此技术曾应用于妇科细胞学涂片标本以鉴别癌细胞。

展望和问题