关于荧光技术介绍

[拼音]：yingguang jishu

[外文]：fluorescent technique

某些物质受一定波长的光激发后，在极短时间内(10-8秒) 会发射出波长大于激发波长的光，这种光称为荧光。这一发光现象在各方面的应用及有关的方法称为荧光技术。

荧光的发光机制

光照射物质时，光量子打到分子上，大约在10-15秒内被吸收，原来处于基态的电子被激发到较高的能级，从而使分子处在激发态。此后，激发态分子通过内转换过程把部分能量转移给周围分子，使较高激发态的电子很快回到最低激发态的最低振动能级（亦称第一单线态）。处在第一单线态的分子的平均寿命是10-8秒左右。如果这种分子通过发射出相应的光量子而回到基态的各个不同的振动能级，即可产生荧光，根据回到的振动能级的不同，荧光的波长就不同，从而形成荧光发射带光谱。由于发射荧光前已有一部分能量被消耗，所以发射荧光所相应的能量要比物质吸收的光能量小，故而荧光的发射特征波长总比激发特征波长长。

物质能否产生荧光，主要和物质本身的结构及周围介质环境（如溶剂极性、pH值、温度等）有关。

荧光技术中有关的概念和参数

固定发射波长，用不同波长的激发光激发样品，记录下相应的荧光发射强度，即得激发光谱。

固定激发波长，记录在不同波长所发射的荧光的相对强度，即得发射光谱。

荧光的相对强弱，与很多因素有关，可用下式表示：F＝FφI0(1－e-εbc) (1)式中F表示荧光强度；K是仪器常数；φ为荧光量子产率；I0是激发光强度；ε是样品的克分子消光系数；b为样品池的光径长度；c为样品浓度。当浓度很稀时(1)式可近似为下式：

F＝KφI0 (2)

从此式可知，在低浓度条件下，样品浓度和荧光强度呈线性关系。

量子产率一般用φ表示，其定义如下式所示：φ＝发射量子数／吸收量子数 (3)

用τ表示荧光寿命，并以下式定义之：

F(t)＝F0e-t/τ (4)

该式表达了荧光物质被一瞬时光脉冲激发产生的荧光随时间的衰减。荧光寿命 τ就是荧光强度下降到最大荧光强度F0的1/e时所需要的时间。

荧光偏振常用偏振度表示，其定义如下：

(5)

式中表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度；是上述两方向互相垂直时的荧光强度。当P＝0时，说明完全不偏振；P在-1至+1之间即为部分偏振。

荧光技术在生物化学及分子生物学研究中应用

不同的荧光物质有不同的激发光谱和发射光谱，因此可用荧光进行物质的鉴别。与吸收光谱法相比，荧光法具有更高的选择性。

利用在较低浓度下荧光强度与样品浓度成正比这一关系可以定量分析样品中荧光组分的含量，常用于测定氨基酸、蛋白质、核酸的含量。荧光定量测定的一个优点是灵敏度高，例如维生素B2的测定限量可达1毫微克／毫升，这一优点使测定时所需要样品量大大减少。

这种定量测定方法还可应用于酶催化的反应，只要反应前后有荧光强度的变化，就可用来测定酶的含量及酶反应的速率等。

研究生物大分子的物理化学特性及其分子的结构和构象。荧光的激发光谱、发射光谱、量子产率和荧光寿命等参数不仅和分子内荧光发色基团的本身结构有关，而且还强烈地依赖于发色团周围的环境，即对周围环境十分敏感。利用此特点可通过测定上述有关荧光参数的变化来研究荧光发色团所在部位的微环境的特征及其变化。在此研究中，除了利用生物大分子本身具有的荧光发色团（如色氨酸、酪氨酸、鸟苷酸等，此类荧光称为内源荧光）以外，可将一些特殊的荧光染料分子共价地结合或吸附在生物大分子的某一部位，通过测定该染料分子的荧光特性变化来研究生物大分子，这种染料分子被称为“荧光探针”，它们发出的荧光一般称为外源荧光。荧光探针的应用，大大地开拓了荧光技术在分子生物学中的应用范围。

利用荧光寿命、量子产率等参数可以研究生物大分子中的能量转移现象。通过该现象的研究，可以获得生物大分子内部的许多信息，如分子内两基团之间的临界距离可根据弗尔斯特公式来测定，弗尔斯特公式如下：

(6)

即是两荧光发色团之间的能量传递的速率 KDA和它们之间的临界距离R0的六次方成反比。式中的KDA、K、J 等均可由荧光寿命、量子产率及荧光强度的测定来推算，从而可以得知两基团之间的距离。

以往人们常用荧光偏振做指标来研究生物大分子动力学。近年来人们趋于用荧光偏振随时间的衰减来研究这些问题。在这种方法中，激发光不是一连续的面偏振光，而是一偏振的光脉冲，因此测得的和是在两个不同方向上偏振的荧光随时间的衰减，它既和荧光寿命τ 有关，又与分子在溶液中的运动有关，因此常表示为(t)和(t)。由它们可得一相当重要的物理量──各向异性参数A(t)。

(7)

由A（t）可推测生物大分子的形状、分子转动弛豫时间（即从一个定向的状态到一个无定向状态所要的时间），进而可以推知生物大分子的大小、分子在溶液中的转动角度和时间之间的函数关系。由这些结果可以研究分子之间的相互作用、分子间结合的紧密程度、蛋白质、核酸分子的解聚程度等等。

另外，荧光技术在免疫学中亦有广泛的应用。最重要的就是荧光抗体法。将某些荧光染料与血清抗体相结合，这种标记的抗体仍可专一地与相应抗原发生结合，形成的复合体具有荧光特性，从而可以确定抗原或抗体的存在及其含量。

仪器

荧光技术中应用的主要仪器有荧光分光光度计和毫微秒荧光计。

该仪器的基本结构如（图1）。主要由激发光源(常用氙灯)、激发单色器、发射单色器、样品池及检测器（光电倍增管）等组成。和一般分光光度计不同，荧光检测是在与激发光垂直方向上进行。结果的显示方式有记录仪、表头、数字显示、打印机等。一些高级荧光分光光度计还连有微处理机处理数据，可进行光谱积分、微分、本底扣除等。在荧光分光光度计的激发光路和发射光路中分别插入一块偏振镜，并使之可以旋转，即可进行荧光偏振的测量。利用荧光分光光度计，可进行荧光激发光谱、发射光谱、量子产率、荧光强度等参数的测定。

根据工作原理的不同可分为脉冲式毫微秒荧光计、位相式毫微秒荧光计，单光子计数毫微秒荧光计等。第一种仪器的原理如(图2)示，用一持续时间极短的光脉冲（大约在毫微秒数量级，10-9秒）激发荧光样品，产生的荧光用快响应的光电倍增管或其他光电转换器件转换成电信号，在相应的示波器上显示出荧光随时间衰减的曲线，用计算机处理该曲线即可得到荧光寿命及其他有关参数。滤光片是用来选择合适波长的激发光和荧光。偏振片用于测量各向异性常数A(t)。利用毫微秒荧光计可以测量荧光寿命、荧光偏振随时间的衰减等参数。

参考书目

1. R.F.Chen， H.Edelhoch (eds)， Biochemical Fluorescence: Concepts， Vol.1， Marcel Dekker Inc.， New York，1976.
2. J.R.Lakowicz， Principles of Fluorescence Spectroscopy，Plenum Press，New York，1983.

参考文章

• 何谓免疫荧光技术？可自发荧光的细胞物质是否可在普通显微镜下看到荧光？生物知识