293T细胞中tau蛋白的表达量高吗

293T细胞中tau蛋白的表达量不会高的

tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白，容易出现磷酸化和糖基化

而293系列细胞中没有tau蛋白，因为293T细胞是很好的基因转染表达模型，同时也是人肾上皮细胞系

所以293T细胞中tau蛋白的表达量应该不会高

简单来说就是蛋白产物表达高的就是搞表达基因,反之就是低表达咯

这个原因很复杂,简单的说,首先,需要量的不同决定了基因表达的不同诱导机制比如说转录因子的多少还有染色体的不同状态也影响表达,异染色质的基因很难表达,还有上下游的调控序列影响转录效率,还有不同的甲基化状态,还有转录后的翻译调控等等详细的说其实可以说上好几本书了

单细胞测序方法和原理系列：

CITE-seq是一种能够同时测定数千个细胞的无偏差转录图谱和基于抗体检测的蛋白标记物的技术。研究发现，这种方法可以同时适用于两种不同的高通量单细胞测序，并通过实例显示出，该方法比单独的单细胞测序数据能够得到更加详细的细胞表型特征。

CITE-seq这个方法在2017年的时候发表在nature methods上。作者还建了一个网站： >

为什么同样细胞系做的基因表达差异倍数不一样

肝脏是人体中最大的实质性器官，主要负责着体内脂类、糖类、蛋白质、和维生素等众多物质的代谢，是人体中的代谢工厂。此外，肝脏在体内还发挥着解毒、免疫、存储糖原和维生素、合成胆汁以及造血等功能，被称之为体内最繁忙的器官。肝脏的复杂功能的发挥依赖于组成肝脏的各种类型的细胞，肝脏细胞主要分成两类：肝实质细胞（HC）和非实质细胞（NPC）。前者是肝脏中最主要的细胞类型，占据肝脏体积约80%，发挥着肝脏中的绝大部分功能。非实质细胞主要包括肝窦内皮细胞（LSEC）、枯否细胞（KC）、肝星状细胞（HSC）以及其他一些免疫细胞等。目前，对肝脏细胞的研究往往集中于某一种类型的细胞。本研究同时构建了多种类型细胞的基因表达谱，通过肝脏细胞水平表达谱的全面解析，系统地发现肝脏细胞中表达的新基因或新亚型，深入地了解肝脏不同类型细胞的共性与特性，全新地认识细胞在肝脏器官中的分工与协作。 转录组和蛋白质组作为基因组后继补充研究对象，分别担当传递遗传信息和功能最终执行的角色。而蛋白质组鉴定覆盖度的范围往往是参照编码基因的数目，因此可寻求转录组水平的mRNA鉴定辅助蛋白质组的深度覆盖。除了覆盖度的优势以外，转录组水平在灵敏度和准确性方面具有无可比拟的优势，还可以更精确地鉴定到基因的可变剪接、RNA编辑等信息。目前，转录组测序（RNA-Seq）作为一项新一代测序技术，能在全基因组范围内以单碱基分辨率检测并定量转录片段，成为研究转录组表达谱的重要方法。 首先，我们首次构建了肝脏细胞水平的转录组表达谱。以C57BL/6小鼠动物为模型，采用流式细胞术完成肝脏3种类型细胞（HC、LSEC和KC）的分选，确保各类细胞纯度和活性分别达到95%和85%以上。对细胞提取的RNA，利用新一代测序RNA-Seq技术，每种类型细胞得到3G以上的数据量，满足深度测序目的。

人家养都是在10

cm皿中筛。

转染

24小时后，消化细胞，1:10

传代

，加适当浓度的抗生素（如g-418），抗生素浓度得提前摸好（杀死所有未转染细胞的最小浓度）。几天换一次液，大概需要2周左右，剩下没死的就是了。q头挑出来到24

孔板

继续扩增

抗体广泛存在于生物医学研究、 诊断和治疗的发展中， 且需求量大。然而， 满足全球市场日益增长的抗体需求量是一个巨大的挑战。为了维持抗体的供求平衡， 科学家们发明了更好的方法来优化抗体的表达， 以达到增加抗体的单体积表达量并减少生产成本。由于新的克隆方法、基因改造技术以及一系列的细胞和载体工程技术， 加上发酵技术上的改进， 这些都使抗体表达大大得益。

哺乳动物细胞是临床抗体药物产品使用的主要表达系统， 主要包括Sp2/0骨髓瘤细胞、 NS0小鼠骨髓瘤细胞、 HEK293人胚胎肾细胞和CHO中国仓鼠细胞， 其中以CHO系应用最为广泛。

海星生物致力于工程细胞株构建和改造，为科研加速，为工业赋能！

CHO细胞谱系 

CHO细胞的优点

1CHO细胞遗传背景清晰， 不易传播人类病毒， 具有很高的安全性， 以CHO作为宿主细胞表达生物蛋白质， 容易被药物审核机构， 如FDA审批通过

2 CHO细胞可以通过悬浮驯化适应无血清悬浮培养， 并能够实现在无血清培养基中快速及高密度生长，这为药物的质量控制和大规模生产带来极大的便利和实惠；

3 CHO细胞表达的重组蛋白质能够获得类似于人源蛋白质的翻译后修饰， 如翻译后的糖基化修饰、 唾液酸化修饰等， 生产的蛋白质较其它表达系统更加与人体天然的生物蛋白质相似第四，较少分泌内源性蛋白， 降低纯化难度；

4 CHO细胞已经开发出了多种商业化高效高表达系统， 如二氢叶酸还原酶筛选体系、 谷氨酰胺合成酶筛选体系和遗传霉素筛选体系等。

CHO细胞的异质性特征

CHO细胞在长期传代过程中存在的稳定性表达问题， 主要体现在：

1 CHO 细胞遗传不稳定性引起的表达不稳定

CHO 细胞系基因组本身具有不稳定性。通常， 中国仓鼠体细胞的染色体为 11 对22 条， 而中国仓鼠卵巢细胞的染色体则发生了大面积不稳定重排重组现象， 不同细胞系染色体的数目也不恒定。基因组的不稳定性， 主要表现在其染色体层面上的拷贝数变异。

2 外源基因随机整合引起的表达不稳定

传统方法主要是通过表达质粒转染后， 利用压力筛选从而获得目的蛋白质表达细胞株。因此， 外源基因都是通过随机整合方式， 整合到CHO 基因组内。由于整合位点的不确定性， 可能在细胞培养后期引起表达不稳定。

中国仓鼠卵巢细胞拥有22 条染色体， 其中10 对常染色体及2 条性染色体。而CHO-K1 细胞系则显示出与其有极大的不同，其仅有8 条染色体显示出同普通中国仓鼠染色体相同， 而13个染色体则以“Z” 标志， 因其中包含着染色体重排、 缺失、移位等现象。

1 细胞内的蛋白表达过程

Representation of different steps involved in building an efficient system for protein expression

3 重组蛋白表达工程细胞株的构建流程图

载体构建 →  转染 → 细胞池(pool) 筛选 → 单克隆化筛选 → 批次补料培养筛选 → 蛋白质量筛选 → 细胞株最终选定与建库 → 细胞培养工艺开发与生产

（1）重组抗体表达载体构建：载体元件改造， 密码子优化， 信号肽优化等

（2）影响细胞转染环节的因素：转染效率和细胞活性

（3）单克隆筛选：有限稀释法、ClonePix、FACS

海星使用ClonePlusTM培养基测试多种工程细胞株、肿瘤细胞株、原代细胞株、干细胞株等都能提高20～150%的克隆形成效率（数据来自同一株细胞对比）。

1 载体设计优化

表达载体的设计需要适应表达系统， 以增加抗体的表达， 增加细胞稳定性， 提高转录， 分泌， 选择， 整合的效率。

（1）多种表达载体形式

单顺反子载体， 多启动子表达载体， 以及IRES或Furin-2A元件介导的多顺反子载体等。

（2）表达载体元件选择

启动子与增强子：CMV启动子、 SV40启动子、 EF-1α启动子、 CAG启动子等

PolyA：BGH PolyA、 SV40 PolyA等

筛选标记：代谢型筛选标记MTX/MSX， 抗生素筛选标记等

（3）位置效应与整合位点优化

染色质开放元件、 支架区/基质附着区（S/MAR） 、 FRT/FLP系统、 Cre-loxp系统

VIRUS-Free™基因导入系统优势：

· 稳定整合效率高

· 插入片段大小不受限制

· 表型稳定

2 基因定点整合

使用重组酶系统进行基因定点整合：

首先需要构建平台细胞， 利用模式蛋白（如 GFP 等） 筛选得到宿主细胞基因组中的高表达位点，之后利用 重组酶的特异性， 实现目的基因在该位点的定点整合。

如Flp/FRT 重组酶、 Cre/loxp 重组酶、PhiC31 重组酶、 Bxb1 重组酶等重组酶系统

3 工程化细胞株驯化和改造

宿主细胞关键调节基因上调或者下调表达

靶向CHO细胞关键调节基因， 通过基因工程手段改造和驯化产生CHO细胞亚系，使表现出更好的凋亡抗性、 代谢、 糖基化、 蛋白表达、 细胞周期调节、 增殖、 分泌或细胞骨架动力学。

4 从实际细胞株构建问题中排查优化

对于一个表达量低于预期的抗体， 可选取一个参考表达量正常的抗体进行对照进行研究：

（1） 探究整合位点的异质性影响

（2） 探究表达产物对细胞是否有影响

（3） 探究基因转录水平是否正常

（4） 探究目的蛋白的分泌情况

（5） 探究目的蛋白的折叠装配情况

scater使用 calculateQCMetrics 函数计算QC metrics，它可以对细胞和基因进行一系列的数据质量控制，其结果分别存储在colData和rowData中。默认情况下，calculateQCMetrics函数使用原始的count值计算这些QC metrics，也可以通过exprs_values参数进行修改。

当然，我们也可以设置一些参照（如ERCC spike-in，线粒体基因，死亡的细胞等），计算其相应的QC metrics进行质量控制。

使用 plotHighestExprs 函数可视化那些高表达基因（默认查看50个基因）的表达情况。下图中行表示每个基因，橙色的线(bar)代表该基因在每一个细胞中的表达量，圆圈代表这个基因在所有细胞中表达量的中位数。默认情况下，使用基因的count值计算表达情况，也可以使用exprs_values参数进行修改。

使用 plotExprsFreqVsMean 函数进行可视化

上图趋势中的异常值可能需要进一步的调查。例如，高表达基因的pseudo-genes的比对错误将导致均值低的基因在所有的细胞中表达。相反，PCR的扩增偏差（或稀有种群的存在）可能会导致在极少数细胞中表达具有很高均值的基因。

对于细胞水平上的质控，我们可以查看参照基因（feature controls）的表达量比上总基因表达量的百分比，如果一个基因在总基因表达量上的比例多，而在参照基因（如ERCC）里少，就是正常的细胞，反之则不正常。

plotScater 函数会从表达量最高的基因（默认为500个）中选一部分，然后从高到低累加，看看它们对每个细胞文库的贡献值大小。这种类型的图类似于对芯片数据或bulk RNA-seq数据中按样本绘制箱线图可视化不同样本的表达分布差异。累积表达图更适用于单细胞数据，因为单细胞数据难以一次性查看所有细胞的表达分布的箱形图。

为了查看不同细胞的表达分布差异，我们可以利用colData中的变量将细胞进行分类。默认使用counts值进行绘图，我们也可以通过exprs_values参数指定其他的数据。

For plate-based experiments, it is useful to see how expression or factors vary with the position of cell on the plate This can be visualized using the plotPlatePosition function:

可以使用 plotFeatureData 函数轻松地查看任意两个元数据变量之间的关系：

The multiplot function also allows multiple plots to be generated on the same page, as demonstrated below

This is especially useful for side-by-side comparisons between control sets, as demonstrated below for the plot of highest-expressing features A plot for non-control cells is shown on the left while the plot for the controls is shown on the right

直接通过列数选取想要的细胞

使用 filter 函数根据指定条件选取想要的细胞

根据QC metrics设定阈值筛选高质量的细胞，这里我们选取那些总counts数大于100,000，表达的基因数大于500的细胞。

我们还可以通过 isOutlier 函数计算筛选的阈值，它将阈值定义为距离中位数一定数量的“中位数绝对偏差（MAD）”。超出此阈值的值被认为是异常值，可以假定它们是一些低质量的细胞，而将其过滤掉。这里我们选取那些log(total counts)值小于3倍MAD值的细胞作为outliers。

直接通过基因的表达量过滤掉那些低表达的基因，这里我们选取那些至少在4个细胞中表达的基因。

当然，我们也可以通过一些其他的条件（如核糖体蛋白基因，线粒体基因等）进行基因的过滤。

我们可以使用 plotExplanatoryVariables 函数查看不同解释因素的相对重要性。当对每个基因的不同因子进行表达量的线性回归模型拟合时，我们会对colData（example_sce）中的每个因子计算其对应的R2值。最好在表达量的对数值上执行此 *** 作，以减少平均值对方差的影响。因此，我们首先对基因的表达量进行归一化处理。

上图中每条线对应一个因子，代表所有基因中R2值的分布。当然，我们也可以通过variables参数选择特定的因子进行计算可视化。

在这个小数据集中，total_counts和total_features_by_counts解释了基因表达中很大一部分的方差，它们在真实数据集中能解释的方差比例应该小得多（例如1-5％）。

缩放归一化（Scaling normalization）可以消除细胞特异性偏差，其使特定细胞中所有基因的表达增加或减少，例如测序的覆盖率或捕获效率。

进行缩放归一化的最简便方法是根据所有细胞的缩放文库大小定义size factors，使得平均size factor等于1，确保归一化后的值与原始count值的范围相同。

然后再使用 normalize 函数计算log转换后的归一化值，并将其存储在“logcounts” Assay中

虽然这种归一化的方式很简单，但细胞文库大小归一化并不能解决高通量测序数据中经常出现的成分偏差，它也不能解释影响spike-in转录本产生的差异。我们强烈建议使用来自scran包的 computeSumFactors 和 computeSpikeFactors 函数来进行计算。

批次效应的校正可以解决不同批次中细胞之间表达的系统差异，与比例偏差不同，这些偏差通常在给定批次的所有细胞中都是恒定的，但对于每个基因而言都是不同的。

我们可以使用limma软件包中的 removeBatchEffect 函数来消除批次效应。

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