MSK-IMPACT 技术文档

MSK-IMPACT (Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets) 是美国纪念斯隆卡特琳癌症中心（MSK）的一款 NGS 大panel 产品，自2014年1月起被 MSK 用于制定晚期癌症患者的治疗方案。该Panel 一直进行迭代升级，涵盖基因数量也一直在增长，由2014年的341个基因，到2017年的468个基因，之后又增加了新的肿瘤驱动基因、与免疫治疗及克隆性相关的基因到2020年的已包括505个基因。MSK-IMPACT™于2017年11月16日通过FDA批准，成为第一款通过审批检测组织多癌种多基因的大Panel 产品。

MSK-IMPACT 通过对肿瘤组织 FFPE 样本和 Normal 样本进行 Panel 捕获、NGS测序及生信分析检测，可以广泛检测基因组中的肿瘤基因突变。它采用的测序平台是Illumina HiSeq™ 2500 Sequencer (qualified by MSK)，检测的突变类型有 SNVs、INDEL（<30bp）、MSI，不能检测CNVs、重排和TMB 。本篇文章主要对通过FDA审批 468 个基因版本的MSK-IMPACT 技术细节进行汇总介绍。

附表Appendix 1a 列出了MSK-IMPACT的检测热点，附表Appendix 1b 列出了468个基因和相应的转录本信息，附表Appendix 1c 列出了73个Panel 覆盖深度低，不进行报出的基因和外显子区域信息。

质控要求肿瘤细胞含量大于10%，切片含量大于20%，MSI检测肿瘤细胞含量大于25%

略

利用纯合位点一致性对来自同一样本的Normal样品和Tumor样品的配对情况进行检测，可以预期配对样品纯合位点不一致性较低（<5%）,不配对样品纯合位点不一致性较高（在25%附近）。如果配对样品纯和位点不一致水平较高（>5%）,则被标记为“可能不配对”类型。

检测杂合位点不同等位基因的频率，如果频率异常，对样品进行标记为“可能污染”类型。

Normal样品中不应该含有SNVs、INDEL。分析流程会对Normal样品中的变异热点进行检测，如果有热点的变异频率>1%,对样品进行标记

SNVs( MuTect 软件) 和 INDELs( SomaticIndelDetector 软件) CALL变异流程需要 Normal 和 Tumor 配对样品，如果缺少Normal样品或者Normal样品的平均测序深度较低（<50X）, 则从批处理样品中选择一个Normal样品作为对照。

对NC样品分析用于确定没有污染以及对PC样品分析用于保证分析的灵敏度

Tumor 样品质控要求 98% 的外显子覆盖深度大于200X，配对Normal样品深度大于50X

原始SNV 和INDEL 突变需要经过下面一系列的过滤来保证报出突变的准确性。

（1） VFtumor/VFnormal >=5，AD>=5,VF>=1%

（2） 突变是否在热点突变库中，Appendix 1a 为热点列表

（3） 热点： DP>=20,AD>=8,VF>=2%;非热点：DP>=20,AD>=10,VF>=5%

（4） 过滤注释结果，保留位于外显子区域的非同义突变，移码突变

利用 MSIsensor 软件计算 MSK-IMPACT 覆盖的所有MSI位点的状态。MSIsensor会计算出一个score,如果阈值大于10，标记为MSI-H。

病人组织或者外周血作为Normal样品，如果使用分批中不配对的Normal样品，可能会有一些稀有的胚系突变被当做体细胞突变

阳性对照是3个阳性样品（3个样品各自含有不同的类型和频率的突变信息）的混合，阳性对照的normal样品是统一批次Normal样品的混合，经过流程分析后，检验分析的结果。（1）已知的突变是否检出（2）检出的突变频率和原始样品的突变频率是否一致，Table2是已知的突变频率的样本。

阴性控制样本是以前的重复试验证实的没有肿瘤污染和没有胚系拷贝数突变的FFPE正常样品的混合物。以前的分析已经确定了正常样品特有多态性和频率，将流程产生的862个SNP的突变频率和预期的突变频率进行比较，计算Pearson一致性。预期突变频率应该大于09

No Template Control(NTC)

样品质量控制度量：

这里计算所需要的覆盖深度都用到了功效分析（power analysis）的概念

1a 外显子覆盖深度的确定：

当设定潜在最低检测线如2%时，可以通过功效分析可以计算出某显著水平下的reads的深度。比如当突变频率为10%时，500X深度95%置信区间下，突变频率的范围在75%和13%之间。

所以，将10个不相关的FFPE的Normal样本等摩尔的混合创造了一系列预设的突变频率，最低的突变频率为5%。然后用862个SNPs验证了预设的突变频率和真实突变频率之间的关系。最后试验数据支持使用5%作为报告检测到的突变的下限，实际潜在的频率为10%。

Run内和Run间设置重复，每个样品5个重复

1a Panel 精密度验证（标准品的验证）

10个样本（9个FFPE样本，一个商业细胞系）代表不同的肿瘤类型，不同的突变类型（突变类型已知），不同的突变频率（突变频率已知）。

2b Panel精密度和重复性一致性验证（标准品的验证）

Table6在对已知的突变进行精密度评估时，也对重复样品检出的已知突变外的其他突变进行了重复一致性的验证。

5个重复样本检出的所有突变数目的一致性

5个样品检出的突变频率的一致性

Table7列出了10个测试样本（每个样本5次重复）精密度验证的结果

LoD是某一种突变在所有的重复中，95%的重复都可以稳定的检测出的突变等位基因频率。 本部分就是验证假定突变的LoD。测试分为两个部分。第一部分是梯度稀释，确定可靠的最低突变频率；第二部分是在众多重复中，验证LoD

1a 梯度稀释

选择10个FFPE样本，各选择5个覆盖度最高的外显子和覆盖度最低的外显子。制备5-8个梯度稀释

检出结果 Table10

1a SNV/indel 变异方法的比较

MSK-IMPACT方法与MSK-IMPACT方法正交验证后的原始结果进行了比较。共检测了433个FFPE样本的20个基因的48个外显子，检出267个唯一的突变位点。433个样品中的已知突变共432个样品检测出，一个样品的EGFR基因的INSERT漏检。

检出的一致性Table15A-C

最终的MSK报告的突变分为两种：一种是具有临床意义的癌症突变，一种是具有潜在意义的癌症突变。

1a 临床样本的验证

MSK测试了超过一万例的晚期肿瘤患者，并将病历信息以及突变信息存储在了下列网站。

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问：简述中文科技期刊评价报告用了哪几个指标

答：1、什么是中文核心期刊？对中国（不含港、澳、台）出版的期刊中核心期刊的认定，目前国内比较权威的有两种版本。一是中国科技信息研究所（简称中信所）每年出一次的《中国科技期刊引证报告》（以下简称《引证报告》）；另一种是北京大学图书馆与北京高校图书馆期刊工作研究会联合编辑出版的《中文核心期刊要目总览》（以下简称《要目总览》）。《要目总览》不定期出版，1996年出版了第二版，2000年出了2000版2004年出了2004版。《要目总览》收编包括社会科学和自然科学等各种学科类别的中文期刊。其中对核心期刊的认定通过五项指标综合评估。《引证报告》统计源期刊的选取原则和《要目总览》核心期刊的认定各依据了不同的方法体系，所以二者界定的核心期刊（指科技类）不完全一致。

问：科技期刊的软指标是怎么样的？它有什么特点？

答：这是一个表征期刊即时反应速率的指标，主要描述期刊当年发表的论文在当年被引用的情况。

指该期刊全部被引次数中，被其他刊引用次数所占的比例。这是一个用于评估期刊影响力的学术指标，显示总被引频次扩散的范围。具体意义为该期刊当年每被引100次所涉及的期刊数。指在统计源期刊范围内，引用该刊的期刊数量与其所在学科全部期刊数量之比。指该期刊在统计当年被引用的全部次数中，较新一半是在多长一段时间内发表的。被引半衰期是测度期刊老化速度的一种指标，通常不是针对个别文献或某一组文献，而是对某一学科或专业领域的文献的总和而言。指来源期刊登载论文所涉及的地区数，按全国31个省、市和自治区计（不含港、澳、台地区）。这是衡量期刊论文覆盖面和全国影响力大小的一个指标。

答：根据ISI发布的影响因子（Impact Factor,IF)是美国ISI（科学信息研究所）的JCR(期刊引证报告）中的一项数据。即某期刊前两年发表的论文在统计当年的被引用总次数除以该期刊在前两年内发表的论文总数。这是一个国际上通行的期刊评价指标。影响因子（Impact factor，缩写IF）是指某一期刊的文章在特定年份或时期被引用的频率，是衡量学术期刊影响力的一个重要指标，由美国科学情报研究所（ISI）创始人尤金·加菲得（Eugene Garfield）在1960年代创立，其后为文献计量学的发展带来了一系列重大革新。自1975年以来，每年定期发布于“期刊引用报告”使用《中文科技期刊数据库》同名作者功能，检索西安理工大学第一作者为张明所发表的论文，请写出检索式，检中文献条数，并任选择其中的两篇以标准格式标注。利用《中国学术期刊全文数据库(CNKI)》，检索一个你感兴趣的主题，在检索结果中以被引频次排序，在引用频次最高的前五名文献中任选其一，以标准格式标注出该篇文献及其二级参考文献，参考文献，共引文献，同被引文献，引证文献，二级引证文献，相似文献各一篇。任选一个中文学位论文数据库，查找2007年至今，北京交通大学博士论文收录情况，写出检索数据库名称，检索式，检中文献条数，并任选两篇以标准格式标注。使用BALIS馆际互借系统，借阅一本图书。要求：写出该书所属图书馆及其索书号，并以标准格式标注出该书，BALIS馆际互借系统生成的订单号，并以无格式文本形式复制出“申请单撤销”界面所显示文字。

答：指该期刊自创刊以来所登载的全部论文在统计当年被引用的总次数。这是一个非常客观实际的评价指标，可以显示该期刊被使用和受重视的程度，以及在科学交流中的作用和地位。指该期刊自创刊以来所登载的全部论文在统计当年被引用的总次数。这是一个非常客观实际的评价指标，可以显示该期刊被使用和受重视的程度，以及在科学交流中的作用和地位。这是一个国际上通行的期刊评价指标，是E加菲尔德于1972年提出的。由于它是一个相对统计量，所以可公平地评价和处理各类期刊。通常，期刊影响因子越大，它的学术影响力和作用也越大。

问：简述核心期刊评价方法和评价指标。

答：周明华 等编著的《中国学术期刊评价研究报告——RCCSE权威。专家

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