分子量测定
分子量是有机化合物最基本的理化性质参数【35】。分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。MALDI-TOF是一种软电离技术,不产生或产生较少的碎片离子。它可直接应用于混合物的分析,也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数,也是基因工程产品报批的重要数据之一。MALDI-TOF的准确度高达0.1%~0.01%,远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术,目前可测定生物大分子的分子量高达600KDa。
质谱技术PMF
蛋白质组学是当前生命科学研究的前沿领域。对蛋白质快速、准确的鉴定是蛋白质组学研究中必不可少的关键性的一步。采用MALDI-TOF-MS测得肽质量指纹谱(PMF)在数据库中查询识别的方式鉴定蛋白质,是目前蛋白质组学研究中最普遍应用的最主要的鉴定方法。肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。由于每种蛋白的氨基酸序列(一级结构)都不同,当蛋白被水解后,产生的肽片段序列也各不相同,因此其肽质量指纹图也具有特征性。MALDI-TOF-MS分析肽混合物时,能耐受适量的缓冲剂、盐,而且各个肽片几乎都只产生单电荷离子,因此MALDI-TOF成为进行分析PMF的首选方法。在我们关于蛋白质组学研究的实际工作中,几乎所有的发现均是从这一步开始做起来的!
质谱技术PSD
由于PMF鉴定结果的可靠性受诸多因素影响,使得部分鉴定结果往往不是十分明确,特异性不高。多肽氨基酸序列匹配被认为是特异性最好的鉴定方法。在蛋白质组学研究中,利用质谱测序一般采用两种方式:一种是利用串联质谱(MS/MS)测序;另一种是利用源后衰变(post-source decay,PSD)技术测序。
在反射式MALDI-TOF-MS中,当脉冲激光照射到微量样品与饱和小分子基质混合形成的共结晶上时,能量通过基质传递给样品,导致样品被解析电离,电离后形成的亚稳分子离子在飞经无场区(即飞行管区)时发生裂解(其活化能来自在离子源与基体发生的碰撞,在无场区与残留气体的碰撞,激光辐射及各种热机制等)所产生的子离子(即源后分解碎片离子),可以通过不断改变反射器电压来进行分离、收集并记录于检测器,形成能为多肽和蛋白质一级结构提供十分丰富而有效的结构信息的PSD质谱图。利用PSD谱图,结合数据库检索可以迅速、高特异性地鉴定蛋白质。
目前,在蛋白质组学研究中,部分经2DE分离的蛋白质样品无法通过PMF鉴定或鉴定结果不明确,可将PSD测序功能应用于这些蛋白质的鉴定。随着对PSD技术的不断研究和发展,尤其是结合MALDI-TOF-MS本身所具有的高灵敏度、高通量、样品靶点可多次应用测定、分析时主要产生单电荷准分子离子以及能够耐受一定量的盐和干扰物等特点,PSD-MALDI-TOF-MS将会在蛋白质组学、代谢组学以及药物筛选的研究中发挥更大的作用。
寡核苷酸的分析
随着分子生物学技术和反义核酸药物技术的发展,越来越多的寡核苷酸片段被合成,用以作引物、探针以及反义药物等。对这些片段进行快速检测,以判断合成的是否完全及合成的序列是否正确,是完全必要的。包括MALDI-TOF-MS在内的生物质谱是迄今为止进行这种检测最好的手段。用MALDI-TOF-MS测定分析寡核苷酸,简单、快速、准确、灵敏。结合3’—外切酶和5’—外切酶可以对寡核苷酸全序列进行测定。
1、与LC/MS/MS相比,MALDI-TOF的识别结果不可靠,特别是当一个点中含有多个蛋白时。对于一个点的水解蛋白液来说,其中含有大量的多肽,并且经常含有修饰基团。一般来说,一个蛋白能水解出20~50种肽。用MALDI-TOF质谱测量多肽混合物时,待测组分不能完全离子化,对于一个蛋白得不到足够的肽信息,无法搜索肽数据库进行蛋白的识别。而LC-MS-MS联用能够检测到相当高的肽段数量和氨基酸序列,这样进行蛋白质识别就有了较高的可信度。2、MALDI-TOF也不能进行翻译后修饰蛋白质的分析。具有离子阱的LC-MS-MS技术能够通过解析修饰导致的肽谱质量漂移提供修饰信息,并且能够提供修饰类型和修饰位点的结构信息。
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