Microarray VS RNA-seq---篇一

转录组代表存在于细胞中RNA的全部类型，包括mRNA、rRNA、tRNA以及其它各种非编码RNA等。转录组是了解细胞过程的主要手段，微阵列（Microarray）和RNA-seq（RNA sequencing）是转录组分析中的两种主要技术。它们的主要区别在于，微阵列基于预先设计的标记探针与目标cDNA序列的杂交，而RNA-seq通过测序技术对cDNA链进行直接测序。

微阵列取决于杂交探针，根据杂交信号强度定量基因相对表达水平。

首先从样品中提取总RNA，然后构建cDNA文库。将cDNA与预先设计的带荧光标记的DNA探针在固体表面（spot matrix）混合，互补序列将与微阵列中的标记探针杂交。通过检测微阵列的探针荧光强度，这些探针代表了不同的基因，可获得各基因的相对表达谱。

一般而言，微阵列探针的荧光强度应与样品中互补cDNA（代表转录物）的丰度成正比。但是该技术的准确性取决于所设计的探针，已知序列的碱基组成以及探针杂交的亲和力，因此具有局限性。微阵列技术不能用低丰度的转录本进行，且不能区分同工型以及鉴定遗传变异。此外，探针也常伴随交叉杂交，非特异性杂交等问题。

RNA-seq是一种快速且高通量的方法，不依赖于预先设计的探针或已知的序列碱基特征，因此具有较高的灵敏度和检测新基因以及遗传变异的能力。

首先提取总RNA并在纯化后片段化处理，然后构建cDNA文库，使用高通量测序的方法对cDNA进行测序。获得测序序列后比对到参考基因组上（或者从头组装转录本后再比对），根据测序序列的覆盖情况定量基因表达。

理论上，如果测序深度足够深，则可以覆盖到所有基因，包括尚未发现的新基因，并能实现全长基因水平的定量。并且RNA-seq本身是一种测序技术，能获得基因的碱基组成信息，因此除了用于定量基因表达外，还可用于基因组结构研究，这是微阵列芯片无法比拟的。但是高通量的方法存在一定的假阳性问题是不可忽视的，并且二代测序在建库时也存在非特异性扩增的偏移，三代测序定量相对准确但价格昂贵。

就目前来说，使用RNA-seq进行转录谱和芯片研究都存在，且RNA-seq居多。主要原因，一是数据量大，覆盖基因组范围更广；二是不受物种基因组是否已知所限制；三是RNA-seq数据的灵活度高，并能用于基因组结构分析。

1，RNA-seq 测试原理

测序步骤，先去除保守的rRNA ，→polyA 尾的特性，用磁珠吸附→Mg镁离子溶液打断mRNA→随机引物变成双链合成第一条cDNA（由RNA变成单链DNA）→再合成第二条DNA（双链DNA）→用相应的酶切加上A，加上Y 行接头（adaptor）

主要应用：差异表达mRNA，可变剪切，融合基因，SNP，

RNA 降解评价，RNA的RIN（RNA integrity number ）> 8 分，比较好；

2，WES 测序步骤

总体的思路是用 外显子探针捕获库 去杂交外显子，然后进行pcr扩增，然后进行测序；

steps： 基因组被打断成片段建成 DNA文库→用结合了 生物素探针的捕获试剂盒进行捕获→用链霉素生物素结合磁珠捕获生物素 →洗脱磁珠上的序列→PCR扩增→测序

主要的应用：发现SNP ，插入缺失突变也就是Indel 信息；不适用：基因结构变异（structure variation，SV），对拷贝数变异（copy number variation （CNV））不敏感，如果是大片段的拷贝数变异，比如5M 以上，因为大片段会出现多个外显子，（全基因组测序，发现SV 和CNV），不能发现基因表达的差异；

3，名词解释

biotin ，生物素；streptavidin 链霉亲和素

比较： WES，RNA-seq，这几个测序的差异

单端测序 和双端测序

可以看到每列为一个样本，每行为一个基因的ensmble。

目前肠矩阵中前20个样本为正常样本，后20个样本为肿瘤组织样本，后续我们根据样本的性质建立分组信息表

血的标本有多个时间点，比较特殊，以下筛选及合并血标本

保存分组信息及矩阵信息

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