bamsam格式说明

在SAM输出的结果中每一行都包括十二项通过 Tab分隔（\t） ，缺失值使用’*'或者’0’代替，从左到右分别是：

1 QNAME , 序列的名字 （Read的名字）

2 FLAG , 概括出一个合适的标记，各个数字分别代表：

如果flag值是0，那么说明测序为单端测序且这条read是primary line，一般是该read的最佳比对。这里说一下secondary alignment和supplementary alignment的区别，secondary alignment代表的是该条read比对到多个位置，该条记录为次优比对，在双端测序中，代表hardclip，而supplementary alignment标记为该条比对记录为该read的补充比对记录，关于补充比对记录其实就是嵌合比对，这个常见于三代测序结果中，因为三代测序的reads很长，在比对的时候，遇到大片段的缺失，基因融合或者转座(translocation)时，结果的bam文件中就会出现多条记录，这些记录是相互的补充，有可能只是这条read的一部分，我在二代测序的结果中很容易找到很多的hardclip记录，但是却没有找到supplementary alignment的记录，在三代的比对结果中就比较多了，以下是命令和一个截图：

假如说标记为以上列举出的数目，就可以直接推断出匹配的情况。假如说标记不是以上列举出的数字，比如说83=（64+16+2+1），就是这几种情况值和。

注意看cigar值那一列，就是红框的那一列，都是带有Hardclip的

在三代测序的比对结果中常见2048的supplementary alignment。使用samtools view -f/-F参数可以获取包含/不包含指定flag的内容的条目。

flag的64和128为在(Paired-end sequencing)双端测序中的read1和read2，而flag为16和32则代表双端测序中一条read反向互补，即代表比对到了负链上。

3 RNAME ,参考序列的名字（染色体，contig）

4 POS ,在参考序列上的位置（染色体/contig上的位置）

5 MAPQ , mapping qulity 越高则位点越独特

比对有时并不能完全确定一个短的序列来自参考序列的哪个位置，特别是对那些比较简单的序列。但是会给出一个值来显示这段序列来自某个位点的概率值，这个值就是mapping qulity。Mapping qulity的计算方法是：Q=-10log10p，Q是一个非负值，p是这个序列不来自这个位点的估计值。

假如说一条序列在某个参考序列上找到了两个位点，但是其中一个位点的Q明显大于另一个位点的Q值，这条序列来源于前一个位点的可能性就比较大。Q值的差距越大，这独特性越高。

6 CIGAR ,代表比对结果的CIGAR字符串，如37M1D2M1I，这段字符的意思是37个匹配，1个参考序列上的删除，2个匹配，1个参考序列上的插入。M代表的是alignment match(可以是错配)

Cigar值中的=为完全匹配，X为不完全匹配，M为最优比对，从biostar上看到的一种解释方法如下：

7 RNEXT , mate 序列所在参考序列的名称下一个片段比对上的参考序列的编号，没有另外的片段，这里是’*‘，同一个片段，用’=‘；

8 PNEXT , mate 序列在参考序列上的位置下一个片段比对上的位置，如果不可用，此处为0；

9 TLEN ，估计出的片段的长度，当mate 序列位于本序列上游时该值为负值。Template的长度，最左边得为正，最右边的为负，中间的不用定义正负，不分区段（single-segment)的比对上，或者不可用时，此处为0。另一个解释为：TLEN模板长度，如果reads对在同一条参考序列上，则模板长度为第4列减去第8列加上cigar值中的Match碱基数目。

10 SEQ ，read的序列序列片段的序列信息，如果不存储此类信息，此处为’*‘，注意CIGAR中M/I/S/=/X对应数字的和要等于序列长度；

11 QUAL ，ASCII码格式的序列质量，格式同FASTQ一样。这个指的是碱基质量值，它的算法如下：

这里p指得是碱基判断错误的概率，英文：base-calling error probabilities ，这里在加33之前的值叫Pred quality score

之所以要加33是为了对应ascii码中的可见字符，如果一个碱基的质量为0，那么对应的就是ascii码中的33，也就是！

12 可选的字段（field）

示例：

Template： A DNA/RNA sequence part of which is sequenced on a sequencing machine or assembled from

raw sequences.

Segment： A contiguous sequence or subsequence.

Read： A raw sequence that comes off a sequencing machine. A read may consist of multiple segments. For

sequencing data, reads are indexed by the order in which they are sequenced

Linear alignment： An alignment of a read to a single reference sequence that may include insertions,

deletions, skips and clipping, but may not include direction changes (i.e., one portion of the alignment

on forward strand and another portion of alignment on reverse strand). A linear alignment can be

represented in a single SAM record.

Chimeric alignment： An alignment of a read that cannot be represented as a linear alignment. A chimeric

alignment is represented as a set of linear alignments that do not have large overlaps. Typically, one

of the linear alignments in a chimeric alignment is considered the “representative” alignment, and the

others are called “supplementary” and are distinguished by the supplementary alignment flag. All the

SAM records in a chimeric alignment have the same QNAME and the same values for 0x40 and 0x80

flags (see Section 1.4). The decision regarding which linear alignment is representative is arbitrary.

Read alignment： A linear alignment or a chimeric alignment that is the complete representation of the

alignment of the read.

Multiple mapping： The correct placement of a read may be ambiguous, e.g., due to repeats. In this case,

there may be multiple read alignments for the same read. One of these alignments is considered

primary. All the other alignments have the secondary alignment flag set in the SAM records that

represent them. All the SAM records have the same QNAME and the same values for 0x40 and 0x80

flags. Typically the alignment designated primary is the best alignment, but the decision may be

arbitrary.3

线性比对和嵌合比对：实际上，一条read的比对情况有时候会很复杂，例如一个read可能比对到多个位置，因为基因组非常庞大，存在很多的repeat区域，而二代测序的read一般比较短，在200bp以内，所以这种时候，可能在bam文件就会出现多条记录该read比对情况的记录，它们拥有相同的id，其中的一个较好的比对被认为是"典型的"比对结果，而其他的都被称为“补充的”比对结果。而且就算比对到同一个位置，还有可能有方向性问题，这是也会有两条记录存在，而没有方向问题，单一的最优比对的read就被叫做线性比对，具体表现在bam文件中将只有一条关于该read的比对记录(注意是read而不是paired reads)。

Phred scale： Given a probability 0 <p ≤ 1, the phred scale of p equals −10 log10 p, rounded to the closest

integer.

这个值是在二代测序文件中常常出现的Phred 值，这个值是对p值的一个log变换，可以更加直观的反应p值，Phred值越大，代表p值越小，例如Phred值为10，那么p值则为0.1Phred为20时，p值为0.01 。

根据samtools的说明，1base的文件主要有 SAM，VCF，GFF，Wiggle文件，而0base的文件主要是BAM，BCF，BED这样的文件。

1-based coordinate system： A coordinate system where the first base of a sequence is one. In this coordinate

system, a region is specified by a closed interval. For example, the region between the 3rd

and the 7th bases inclusive is [3, 7]. The SAM, VCF, GFF and Wiggle formats are using the 1-based

coordinate system.

0-based coordinate system： A coordinate system where the first base of a sequence is zero. In this

coordinate system, a region is specified by a half-closed-half-open interval. For example, the region

between the 3rd and the 7th bases inclusive is [2, 7). The BAM, BCFv2, BED, and PSL formats are

using the 0-based coordinate system.

找到一个bam文件并输入如下命令查看title信息

可以看到bam文件的header有如下几个部分组成

https://www.jianshu.com/p/c48c36affff7

https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf

https://genome.sph.umich.edu/wiki/SAM

https://en.wikipedia.org/wiki/SAM_(file_format)

https://www.biostars.org/p/60765/

https://www.cnblogs.com/emanlee/p/4316581.html

https://blog.csdn.net/qq_35696312/article/details/101760397

sam是短序列比对默认的标准格式，是以TAB为分割符的文本格式。主要应用于测序序列mapping到基因组上的结果表示，另外也可以表示其他的多重比对结果。一般把测序reads比对到参考基因组以后，通常得到的就是sam文件。BAM就是SAM的二进制文件，具有更小的存储空间，并且许多下游分析工具使用的是BAM格式。

第1列 ：fastq的read ID

第2列 ：FLAG（如果某一个数值不是下面的任意值，那么那个数值就是下面这些数里面几个的和）

第3列 ：染色体名称。如果这列是“ * ”，可以认为这条read没有比对上的序列，则这一行的第四，五，八，九 列是“0”，第六，七列与该列是相同的表示方法。

第4列 ：比对的位置，从对应上的染色体第1位开始往后计算。没有比对上的，此处为0。

第5列 ：MAPQ比对质量值。越高说明该read比对到参考基因组上的位置越唯一，0表示在参考基因组有多种定位的可能性。60表示在参考基因组只有这一种定位位置。

第6列 ： M表示匹配、I表示插入、D表示删除、N表示内含子和D类似、S表示替换、H表示剪切。

第7列 : 这条reads第二次比对的位置。=表示参考序列与reads一模一样，*表示没有完全一模一样的参考序列。

第8列 : 该列表示与该reads对应的mate pair reads的比对位置（即mate），若无mate,则为0。

第9列 :  序列模板长度，如果同一个片段都比对上了同一个参考序列，为最左边的碱基位置到最右边的碱基位置（左为正，右为负）。当mate 序列位于本序列上游时该值为负值。不可用时，为0。

第10列 : read的序列。

第11列 : ASCII码格式的序列质量。格式同FASTQ一样。其中1、10、11合起来就是fq格式文件。

第12列 : 可选的区域。格式类似AS:i:-1 XN:i:0 XM:i:1 XO:i:0 XG:i:0 NM:i:1 MD:Z:35T0 YT:Z:UU

线性对齐： 一条read比对到参考序列上，可以存在插入(insert)、缺失(delete)、跳跃(skip)、剪切(clip)，但是方向不变（不能是一部分和正链匹配，另一部分又和负链匹配），sam文件中只占用一行记录。

嵌合比对： 由于一条测序read比对到基因组上时分别比对到两个不同的区域，而这两个区域基本没有接触和重叠。因此它在sam文件中需要 占用多行记录 显示。只有第一个记录称作"representative",其他的都是"supplementary"。RNA-seq中的chimeric read或许可以说明有融合基因存在，但在基因组中一般作为结构变异的证据。

sam转换为bam字节为0是由于转换器不支持源文件格式。bam文件和sam文件内容其实是一样的，只是bam是二进制的压缩文件，需要通过特定的软件来进行查看，bam文件通常可以理解为12个字段组成。

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