请问退火、正火、淬火、回火都是什么意思啊？还有这些手段是在什么情况下使用的呢

退火（Annealing），在冶金学或材料工程中，退火是一种改变材料微结构，进而改变如硬度、强度的机械性质的热处理。

过程为将金属加温到某个高于再结晶温度的一点并维持此温度一段时间，再将其缓慢冷却。退火的功用在于回复因冷加工而降低的性质，增加柔软性、延性和韧性，并释放内部残留应力、以及产生特定的显微结构。退火过程中，多以原子或晶格空位的移动释放内部残留应力，透过这些原子重组的过程来消除金属或陶瓷中的差排，然而这项改变动也让金属中的差排更易移动，增加了它们的延性。

在铜、钢铁、银、黄铜的案例中，退火需要历经很高的高温，通常都要让加热到金属炽热为止，并维持一段时间再冷却。不像其它含铁的合金需要缓慢冷却，铜、银[1]和黄铜他们可以在空气缓慢冷却，也可以快速在水中淬火。退火过后的金属之后可以再拿去做进一步加工，如冲压、塑造、成形等。

退火过程中间会有三个阶段。

第一阶段是回复（recovery）。在回复的过程中，晶体内部缺陷（例如空位）会移动回复到正常晶格位置，同时内部应力场也会跟着消失。在回复阶段，先前的冷加工过的金属其电、热传导等性质将回复成原来状态[4]。第二阶段是再结晶（recrystallization）。再结晶过程中，新的晶粒成型，当退火过程继续进行中取代原本因内在应力而变形的晶粒[4]

。再结晶完成时，晶粒成长（grain

growth）就会开始。晶粒成长过程中，小的晶粒会与大的晶粒合并，减少材料内部晶界的数目。晶粒成长的程度会严重影响到材料的机械性质。

正火是一种退火程序，借着加热来细化晶粒，释放应力。

这过程通常受限用于硬化钢，在受过塑性变型的钢，其晶粒呈现不规则的形状，且晶粒相对大小不一，正常化即是为了产生细小、并均匀化的晶粒，来改善它的延展性和韧性。正常化是借由把钢加热至上临界温度之上，即沃斯田铁化温度之上，之后浸入此温度一小段时间，让它在空气中冷却。在足够的时间之后，使铁碳合金完全沃斯田铁化（austenitizing）[5]。透过正常化，可进一步进行其他热处理程序。

淬火，一种热处理工艺。把合金制品加热到一定温度，随即在含有矿物质的水、油或空气中急速冷却，一般用以提高合金的硬度和强度。通称“蘸火”。

回火是将淬火钢加热到奥氏体转变温度以下，保温1到2小时候冷却的工艺。回火往往是与淬火相伴，并且是热处理的最后一道工序。经过回火，钢的组织趋于稳定，淬火钢的脆性降低，韧性与塑性提高，消除或者减少淬火应力，稳定钢的形状与尺寸，防止淬火零件变形和开裂，高温回火还可以改善切削加工性能。

依据加热温度不同，回火分为：低温回火

加热温度150-200℃。淬火产生的马氏体保持不变，但是钢的脆性降低，淬火应力降低。主要用于工具、滚动轴承、渗碳零件和表面淬火零件等要求高硬度的零件。中温回火

加热温度350-500℃。回火组织为针状铁素体和细粒状渗碳体（FeC）的混合物，称为回火屈氏体。中温回火能获得较高的d性极限和韧性，主要用于d簧和热作磨具回火。高温回火

加热温度500-600℃。淬火加高温回火的连续工艺称为调质处理。高温回火组织为多边形的铁素体（ferrite）和细粒状渗碳体（FeC）的混合组织，称为回火索氏体。高温回火为了得到强度、硬度和塑性韧性等性能的均衡状态，主要用于重要结构零件的热处理，如轴、齿轮、曲轴等。

要进行shRNA载体构建，首先需要根据自己的基因，设计出对应的 靶点 、 loop序列 ， 酶切位点序列 ，详见 LncRNA的shRNA慢病毒载体引物设计 -

引物先用10000g在4°离心2min，再按照说明书的要求，加入DEPC或者无酶ddH2O将寡核苷酸稀释为100 μM。

按以下体系配制 退火反应体系 ：

无酶ddH2O补足 20 μl

正义寡核苷酸（100 μM） 2μl

反义寡核苷酸（100 μM） 2μl

10X T4 DNA连接酶缓冲液 1μl (这一步骤 可选，也可不加 ，直接加无酶ddH2O)

一般来说，把小体积液体往大体积液体中加，相对会更准确，所以答主一般先加ddH2O。

退火反应程序： 注意需要 缓慢退火

1. PCR法 ：将配制好的退火反应缓冲液重复混合，瞬时离心后放置在PCR仪上，先95℃ 4min，再70℃ 10min，然后在数小时内缓慢冷却至室温。运行以下程序：95℃ 4min，70℃ 10min，55℃ 10min，40℃ 10min，25℃ 10min，10℃ 10min，4℃ ∞。

2. 沸水烧杯法 ：把tube放在在PCR仪或沸水烧杯中95°C孵育4分钟，4min后将烧杯从火焰中取出，并让水自然冷却至室温。

酶切体系：（这里用的是NEB的酶和buffer）

①无酶ddH2O 或DEPC：补足至30uL

②plasmid：体积=5ug/质粒浓度

③10X cutsmart：3uL

④限制性内切酶1：2uL

⑤限制性内切酶2：2uL

胶回收：

本组用的是 Omega gel extraction mini kit， E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit (V-spin) | Omega Bio-tek ，超详细步骤可见 过表达载体合成步骤 - 。

胶回收可以很大程度上 避免 DNA连接时发生 载体自连 的情况！

DNA连接体系：

双链DNA寡核苷酸：5uL

骨架plasmid：150~200ng/胶回收后的plasmid浓度

T4 DNA连接酶：2uL

T4 DNA连接酶buffer：2uL

ddH2O补足至20uL

16℃连接，过夜or 4小时均可

质粒转化：

取连接产物与30ul 感受态细菌（对于 慢病毒载体 ，最好选择 stable3菌株 ，更有利于质粒稳定；而对于原核表达的载体，最好选择Rosetta菌株）混匀后 冰浴30min ， 42℃热激90s ，立即置 冰上放置5min ,加入预热至室温的700ul LB培养基， 37℃恒温培养30min，吸取 200ul的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含50ug/ml Ampicillin抗性（根据骨架载体的特征来选，这里用的是pKLO.1质粒，因此选Amp）的LB平板上， 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。

1.在LB平板上挑出4~6个单克隆，加入LB培养基及筛选抗生素，37℃shake ，做质粒抽提。

2.测序验证

由于shRNA载体中的片段较小，一般只有几十个bp，因此，若要做双酶切验证，很可能看不到条带，直接做测序。

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