电子克隆基于表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)的电子克隆(in silico cloning)策略,是近年来发展起来的一门快速克隆基因的新技术,其技术核心是利用生物信息学技术组装延伸ESTs序列,获得基因的部分乃至全长cDNA序列进一步利用RT-PCR的方法进行克隆分析、验证。
电子克隆(in silico cloning)
选择数据库“Nucleotide”,利用blastn程序进行同源性检索。
从GenBank的核酸(nr)数据库中检索已测序列植物的目的基因,获得目的基因cDNA序列,以该序列为模板对另一种未测序列植物EST数据库进行BLAST检索,获得与之部分同源的EST群,从中选取一条EST作为种子序列BLAST检索该植物的EST数据库,将检出与种子序列同源性较高或有部分重叠的EST序列拼接组装为重叠群(contig),再以此重叠群序列重复以上BLAST检索过程,反复进行EST重叠群序列的拼接和比对,直至检出所有的重叠EST或重叠群不能继续延伸,最终获得未测序列植物基因的cDNA全序列。随着EST数据库的进一步完善,电子克隆策略已成为克隆新基因的重要方法,并成功地应用于人类基因组的研究。利用EST资料的电子克隆是克隆功能基因的新途径,核笑与传统的基因克隆方法相比,具有快捷、成本低、针对性强等特点,但也受到dbEST的EST数量和质量的限制,因此在EST资料非常丰富的模式物种(如人、鼠等)中应用较多。在实际应用中,以模式物种某一已知基因序列为起点斗滚,结合目标物种EST数据库,采用现代生物信息学及实验验证相结合的技术方法,尤其是通过同源性比较完全有可能快速改销含筛选到一些具有重要功能的基因。
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