DNARNA序列比对软件整理

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在对比对工具进行比较时，通常将其分为DNA比对工具（DNA-seq）和RNA比对工具（RNA-seq）。它们的区别在于是否会考虑跨外显子的比对，即：是否会将没有比对上的reads劈开，对劈开后的两部分再次比对）。

随着现在各种seq测序的出现，我们已经不能简单的根据是比对DNA还是RNA来判断。比对工具的选择主要依据reads的比对是否需跨外显子。（PRO-seq/GRO-seq，它们虽然在建库时捕获的RNA，但是它们的比对并不需要考虑跨外显子。）

常用工具：

DNA-seq：BWA；bowtie&bowtie2

RNA-seq：STAR；HISAT2；Tophat&Tophat2

BWA主要应用二代测序后的大量短小片段与参考基因组之间的定位比对。需要先嫌燃对参考序列建建立索引，BWA也是基于 BWT和 FM-Index 理论来对参考基因组做索引。根据测序方法的不同，有单末端序列(Single-end，SE)比对和双末端序列(Pair-end，PE)比对。

bowtie出现在测序行业还不成熟的时候，序列长度普遍在50bp以下，bowtie的只满足长度在50bp以下的reads的比对。官方称其可以把短的DNA序列（35bp）快速的比对到人类基因组上。

Bowtie2 是一款经典的短读长序列（ 50-100 bp，最多可到1000 bp ) 比对软件，节约内存且灵活与成熟的短序列比对软件，比较适合下一代测序技术。支持单端测序（unpaired) 和双端测序的比对。支持全局比对（end-to-end align ) 和 局部比对( local align )。其通常使用全文分索引(FM-index)以及Burrows-Wheeler 变换(BWT)索引基因组使得比对非常快速且内存高效，但是这种方法不适合于找到较长的、带缺口的序列比对

结论：bowtie和bowtie2，是两个不同类型的比对工具，bowtie2并非是bowtie的升级。尺有所长寸有所短，bowtie适合长度在50b长度以内的reads比对，而bowtie2适合50-100b，甚至更长的reads比对。但是这两个都属DNA-seq比对工具

RNA-Seq测序的特性，天然的会有一部分数据延伸到内含子区，这部分跨越外显子和内含子的reads就称为『junction reads』，所以RNA-Seq比对软件需要针对此进行优化。

（ junction：转录组reads比对不同于基因组reads比对(如ChIP-seq、WES等)的地方在于，比对的reads可能来源于2个被内含子隔开的外显子区域，导致reads一端比对在第一个外显子的后面部分，另一端比对在第二个外显子的前面部分，芹衡虚即跨剪切位点，从而形成exon-exon junction (剪接点)。这些reads又称为junction reads，对转录本的拼接、鉴定和差异分析具有重要的意义。）

（soft-clip事件: 即reads末端存在低质量碱基或接头导致比对不上的， STAR会自动尝试截去未比对部分，只保留比对上的部分。）

STAR是ENCODE皇家御用的RNA-seq比对工具，ENCODE计划(ENCyclopedia Of DNA Elements)又称人类基因组DNA元件百科全书计划，是2003年在人类基因组计划完成之后紧接着的又一个大型国际科研项目。

Tophat2的原作者们也不知道是出于什么考虑，不再更新Tophat2，转而开发了一个新的比对工具HISAT2，更是推荐人们使用HISAT2，声称其速度更快，内存占用率更小，准确率更高。

此外，HISAT2不仅支持RNA-seq的比对还支持DNA-seq比对，唯一需要做的就是加上一个参数--no-spliced-alignment。但是就目前拦散来看，大部分人都是使用HISAT2做RNA-seq，没人使用它做DNA-seq

Tophat/Tophat2工具本身不能进行比对，它是通过调用bowtie/bowtie2进行比对的。划重点，bowtie2不是bowtie的升级版，但是Tophat2是Tophat2的升级版。因此Tophat只可以调用bowtie，而Tophat2不仅可以调用bowtie2（默认）还可以更改设置调用bowtie。

Tophat/Tophat2调用bowtie/bowtie2后，会首先使用bowtie/bowtie2对序列进行比对，对于那些没有比对上的，会考虑其跨外显子的可能性，将reads劈开重新比对。

全长转录组（Full-length transcriptome）是基于PacBio和Nanopore三代测序平台，无需打断拼接，直接获得包含5’UTR、3’UTR、polyA尾的mRNA全长序列及完整结构信息，从而准确分析有参考基因组物种可变剪接及融合基因等结构信息，克服无参考基因组物种转录本拼接较短、信息不完整的难题。同时还可以借助二代测序数据，进行转录本特异性表达分析，获得更加全面的注释信息。

传统的使用比较多的长读长比对软件是GMAP，05年发表公布，最开始是用来比对低通量的est序列的，后来也有进一步升级为GSNAP支持高通量的二代测序。PacBio测序技术出现后，常用于Iso-seq转录本的鉴定，目前仍是相关研究引用量最高的比对软件，该软件也一直在持续更新升级。其可以将转录本序列与参考基因组序列比对，输出gff文件，比对速度稍慢。

Minimap2是生信大牛李恒18年用C语言开发的可以用于三代数据（subreads、iso-seq）比对的长序列比对软件，与传统的三代比对工具GMAP相比，其速度有非常显著的提升，当然同时消耗的内存也比较大。使用方法也比较简单，近几年引用次数增长的也很迅速，所以大家可以试试用minimap2进行Iso-seq的比对。

1、打开NCBI，搜索差简基因

2、找到该序兄庆槐列的CDS序列，输入到序列的标准格式的文件中

点击CDS序列

输入到标准的SEQ格式中

选择需要比对的序列，Done即可

4、点羡友击Align中的 By clustal W method

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