实现MAC绑定功能需要三个步骤：
1作ARP静态绑定：set arp 192168052 0000e26e4743 e1
2强迫执行ARP目地IP扫描：set arp always-on-dest 这个命令是隐藏的。直接输入命令生效。
3设置一个地址组group，它只包含做MAC地址绑定的那些IP地址。然后设置一个策略，只让这个地址组group通过。
使用MAC地址绑定要注意两点：
只有那些和端口在同一网段的IP地址才能进行MAC地址绑定，仅适合单一网段的环境。
很多软件可以轻而易举地改变计算机信息包的MAC地址，防火墙无法识别真假MAC地址，由此造成系统不安全。发表期刊： Clin Cancer Res
发表日期：2020 Mar 27
影响因子：12531
DOI:101158/1078-0432CCR-19-3283
易位肾细胞癌（tRCC）是一种罕见的侵袭性肾细胞癌亚型。MiTF-家族易位肾细胞癌（tRCC）分别约占成人和儿童肾细胞癌（RCC）病例的4%和415%，儿科病例通常显示出更有利的结果。该疾病的特征是转录因子TFE3或TFEB（分别在染色体位点Xp112和6p21上）与潜在转录活性更强的位点之间的融合。MiTF转录因子参与调节与细胞生长、代谢和溶酶体生物发生相关基因的调控，但触发肿瘤发生和驱动tRCC侵袭性的具体途径和分子机制尚不清楚。目前，在这种罕见且具有侵袭性的RCC亚型中，没有预后生物标志物，也没有针对晚期疾病的标准治疗。
1数据来源
(1)MSK-IMPACT 队列（发现）：确定了37名tRCC患者，基于多种因素将15个样本排除后最终将得到22个tRCC患者样本。（图S1A）
(2)MSK-外显子组队列：MSK-IMPACT队列的一个子集（n = 10）接受了额外的全外显子组测序（WES）
(3)TCGA-外显子组队列（验证）：从癌症基因组图谱全肾（TCGA-KIPAN）队列中鉴定出患有tRCC的非MSK患者，最终确定了12个TCGA样本（图S1B）。
2实验方法
(1)MSK-IMPACT 靶向测序：
(2)全外显子组测序、处理和突变分析：
(3)等位基因特异性拷贝数分析（ASCN）：生物信息学算法FACETS进行
(4)肿瘤突变负荷（TMB）的计算
(5)癌细胞分数分析：癌细胞分数（CCF）为≥09的突变被定义为克隆突变，所有其他突变都被认为是亚克隆的。使用这些定义，通过将亚克隆和克隆突变的数量（#subclonal / #clonal）的数量来计算瘤内异质性（ITH）指数（范围0，+∞）
(6)新抗原预测和免疫细胞反卷积：评估了tRCC病例和其他RCC组织学之间与血管生成、PD1、PD-L1和CTLA4相关的特征表达的差异。用单样本RNA序列数据中先前描述的基因特征进行了基因集富集分析（ssGSEA）。通过ssGSEA来计算每个样本中感兴趣的基因集的相对过度表达。
(7)统计分析：分析具有完整基因组信息的病例（n=22）。FCNAg与基线检查时的临床病理变量（即临床分期和年龄）之间的相关性采用Mann-Whitney U检验进行检验。用同样的方法对tRCC和TCGA中的其他RCC亚型（KIRC、KIRP、KICH）之间分别进行TMB比较，以及评估两组之间 FCNAg的差异。 在 tRCC 和相应 TCGA 亚组（KIRC、KIRP）内的其他肿瘤之间测试了 PD-L1 基因表达的差异。
作者专注于MSK-IMPACT队列中体细胞突变的分析。在排除TFE融合和拷贝数改变后，15/22（682%）患者表现出体细胞单核苷酸变异或内嵌，在5/22（227%）样本中，SWI / SNF和DNA损伤修复（DDR）途径中可能存在致癌驱动突变。 作者在三名患者中发现了激活的TERT启动子突变（C228T），所有这些突变都发生在高AJCC阶段，这表明TERT的激活可能是侵袭性tRCC的新标志物。 作者使用等位基因特异性拷贝数分析（ASCN）确定了1/2 ATM突变和1/1的SMARCA4突变是克隆的，其中只有克隆ATM突变伴有互补等位基因的杂合性丧失，这表明该病变可能是肿瘤发病机制中的躯干驱动事件。
TMB在许多实体癌中可作为对ICB有良好反应的生物标志物。由于使用靶向NGS难以在低突变负荷肿瘤中准确定量TMB，作者从MSK外显子组队列的10名患者和TCGA外显子组队列的12名患者的外显子组测序中评估了TMB，计算出tRCCs的TMB中位数为080 mut/Mb(图1C)。与所有其他TCGA-RCC队列不同，TMB在TCGA和MSK外显子组队列中是一致的 。此外，tRCC的TMB与其他RCC亚型的特征不同：与肾透明细胞癌 (KIRC) 和肾乳头状细胞癌 (KIRP) 相比较低，但与嫌色性肾细胞癌 (KICH) 相比较高（图1B）。在TMB特别高的离群的tRCC病例中没有发现推定的解释性突变。
使用整体瘤内异质性的指标（ITH指数）总结了体细胞突变的克隆性。考虑所有突变的所有tRCC外显子组样本的中位ITH指数为082，表明克隆事件的发生率高于亚克隆事件。这与tRCC的进化模型一致，即早期体细胞突变发生，随后发生少量亚克隆突变。这些结果表明，从突变的角度来看tRCC肿瘤表现出；相对较低的突变负担；除了MiTF易位外，典型的致癌突变事件相对较少；以及在肿瘤抑制基因功能丧失突变的情况下，野生型等位基因很少同时发生杂合性丧失（LOH）。
作者评估了TCGA-tRCC样品中免疫原性和肿瘤微环境的组成，在8/14（571%）病例中鉴定出融合衍生肽的显着HLA表位结合亲和力，中位亲和力为985 nM。还使用免疫反卷积技术来测试ccRCC中血管生成和三种免疫治疗靶标的基因特征的差异：PD1，PD-L1和CTLA4。 与乳头状RCC相比，tRCCs 中的血管生成基因表达特征更高，相对于透明细胞肿瘤较低但几乎等效。与KIRC和KIRP队列相比，tRCCs也显示出更高的PD-L1表达特征。 发现CTLA4或PD1特征没有显著差异。
在先前的tRCC分析中，染色体臂9p的丢失和臂17q的增加是常见的，在17q增加的情况下，可能是预后的生物标志物。与之前的研究相比，本研究使用了等位基因特异性拷贝数分析（ASCN），能够更敏感地检测到杂合性事件的小增益和拷贝数中性丢失。因此作者评估了tRCC中总拷贝数事件与临床特征和OS之间的关联。首先计算基因组中出现拷贝数改变的部分（FCNAg）。MSK-IMPACT队列的FCNAg中位数为016，TCGA队列的FCNAg中位数为009。在TCGA队列中，发现高AJCC阶段（III/IV）与较高的FCNAg相关，但在MSK-IMPACT队列中，这一结果没有统计学意义（图2）
接下来，作者更深入研究了MSK-IMPACT队列中的拷贝数改变。在MSK-IMPACT队列中最常见的臂水平拷贝数改变是9/22（41%）患者丢失9p，8/22（36%）患者增加17q，8/22（36%）患者增加6p。在MSK-IMPACT队列中，没有单拷贝数事件与总生存率显著相关。然而，在9p缺失的肿瘤中发现了3/3 TERT突变，并且在MSK和TCGA两个队列中9p缺失的存在与较高的FCNAg显著相关（图3）。
基于tRCC相对较低的TMB和相对较高的拷贝数改变频率，作者试图评估临床结果与拷贝数变化汇总测量之间的关联。定义了一个拷贝数异常的患者队列，其特征为9p丢失、17q增加或FCNAg高于队列内中位数。在MSK-IMPACT队列中，15例拷贝数异常（CNA）肿瘤患者的总体生存率较差；在TCGA队列中，这项分析没有统计学意义，然而，生存点估计值非常相似（5年OS 571%对100%），这表明可能由于TCGA数据样本量不够导致分析结果不够有力。MSK-IMPACT队列中的两个肿瘤和TCGA队列中的两个肿瘤表现出CDKN2A / B的双等位基因缺失；以生存分析为目的，将这些肿瘤作为一个单独的组治疗并没有产生有意义的影响，这表明该基因的双等位基因缺失并不是CNA肿瘤预后不良的唯一驱动因素。因此，作者对两个队列的结果进行了荟萃分析，该分析 证明了拷贝数异常肿瘤状态与生存率差之间存在统计学上的显著关联。
这一步研究确定了一个在机构接受治疗的患者，该患者具有作为TCGA联盟一部分测序的早期tRCC肿瘤样本。该患者最初在大约20年前因45厘米的肾脏肿块接受了部分肾切除术，该肿块被诊断为高级别乳头状RCC。8年后，在切除原始肿瘤的同一肾脏中发生局部复发，导致患者接受完成根治性肾切除术，并伴有腹膜后淋巴结清扫术（TCGA样本BQ-5887）。需要注意的是，在此过程中获得的所有淋巴结都被发现没有肿瘤。与先前的标本相比发现这种局部肾脏复发具有一致的形态学特征，以及TFE3基因重排，这促使最初的诊断改为 MiTF 家族 tRCC。病人在8年多的时间里一直没有患病，之后由于疾病在上腹部和腹膜后广泛扩散而出现严重的腹痛和背痛。其中一个腹膜后淋巴结被活检，发现还具有 PRCC-TFE3 融合（MSK-RP-5887 样本）。此时，患者被诊断为转移性疾病，并开始系统治疗（图 4)。在对依维莫司/贝伐珠单抗部分反应的初始阶段后，腹部病变趋于稳定，随后再次生长（胸部也出现了新的疾病部位）。此时，治疗被停止，患者接受了二线治疗，这导致了混合反应，即某些病变缩小，但其他病变扩散。在三线治疗（加上显著的TKI相关毒性）开展后，患者拒绝接受其他治疗，并决定接受临终关怀护理。
新发现的肿瘤经病理证实为淋巴结转移，有PRCC-TFE3融合的证据（经IHC和FISH以及MSK-IMPACT测序证实）。 为了解这些肿瘤的克隆相关性，作者进行了淋巴结转移的外显子组测序，并比较了MSK-RP-5887和TCGA-BQ-5887之间的拷贝数畸变和突变。有趣的是，这两个样本在整个基因组中都表现出全基因组加倍（WGD）和广泛的拷贝数改变，因此与其他tRCC肿瘤相比FCNAg异常高。 事实上，绝大多数手臂水平的事件（78%）是两个肿瘤共同发生的。值得注意的是，在这两个样本中，染色体9p的缺失是明显的，而且在这两个病例中，它都发生在WGD事件之前。 这些发现与CNV是肿瘤发展的早期事件一致。相比之下，只有23%的体细胞突变在两个肿瘤之间共享（ITH指数，MSK-RP-5887：53，TCGA-BQ-5887：16），表明在最近的共同祖先（MRCA）分化后发生了广泛的突变多样化。总之， 这表明在这种特殊的tRCC肿瘤中，拷贝数改变发生在肿瘤进化的早期，而大部分体细胞突变的获得发生在后期 （图 4)。该结果与上述报告的中位ITH指数结果（082）不一致，可能反映了转移性与原发性tRCC的不同进化模式。
作者评估了 MSK-IMPACT 队列中 14 名患者的治疗反应，这些患者在大多数情况下接受了多线系统治疗。14 名患者中有 5 名（357%）在一线或二线治疗中表现出延长的 TOT（>12 个月）。在比较应答者与非应答者时，发现FCNAg的中位数没有差异。值得注意的是，一名对ICB治疗有长期反应的患者在PBAF染色质重塑复合物的两个基因SMARCA4和PBRM1中存在错义突变，这两个基因的变异最近与免疫原性特征有关。
最后，作者评估了18岁以下（n=3）患者的分子改变。他们的发病部位和治疗过程如图6所示。两名患者之前接受过化疗：一名是视网膜母细胞瘤患者，他也有种系RB1突变的证据 ；另一名是神经母细胞瘤患者。所有儿科病例均未出现9p丢失或17q增加，并且一致地发现， 与老年患者相比，儿童的FCNAg显著降低。
CNV似乎在tRCC的预后中起着关键作用。拷贝数畸变在 tRCC 中普遍存在，并且似乎会导致不良结局。晚期疾病病例中 TERT 热点突变的存在表明与 tRCC 的分子进展相关。成年患者中致癌事件（包括体细胞突变和CNV）频率的增加可能会驱动更具侵袭性的疾病表型。tRCC独特的免疫表型特征值得进一步探讨。今天跟大家分享的是发表在 ONCOIMMUNOLOGY （IF: 8110）上的一篇文章，主要是对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在EGFR/ ALK阳性非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤免疫微环境中的作用进行探究。TKI在携带EGFR突变和ALK重排的非小细胞肺癌治疗过程中发挥关键作用。然而，TKI对肿瘤免疫微环境(TIM)的影响尚未完全阐明。因此，研究者们对TKI治疗前后EGFR/ ALK阳性的NSCLC样本进行RNA测序和全外显子测序，结合新抗原和突变负荷分析，使用xCell和单样本基因集富集分析(ssGSEA)评估肿瘤免疫细胞浸润与活性。此外，还基于基因加权相关网络分析识别与治疗和免疫应答相关的hub基因并在公共数据集合中进行验证。
综合分析表明酪氨酸激酶抑制剂(TKI)诱导EGFR/ ALK阳性非小细胞肺癌肿瘤免疫微环境重构
Comprehensive analyses reveal TKI induced remodeling of the tumor immune microenvironment in EGFR/ALK-positive non small-cell lung cancer
1数据
本文数据包括来自于公共数据集的TCGA肺腺癌数据，GSE11969中34例EGFR突变肺癌样本的微阵列数据和自测的osimertinib（TKI靶向药物）治疗前、后样本的RNA表达数据。
2TKI用药前后的EGFR突变和ALK重排患者的转录组改变
基于t检验分别识别EGFR突变和ALK重排的肺腺癌患者在TKI治疗和响应后发生差异表达的基因（FDR<005），其中1442个基因在治疗后的EGFR突变和ALK重排患者中同时表达上调，1425个基因同时表达下调（图1A-B）。GO富集分析表明，上调的差异基因与免疫应答显著相关，下调的差异基因主要与细胞粘附和连接等过程相关（图1C）。对只在EGFR突变或ALK重排的肺腺癌患者中发生差异表达的基因进行分析，发现与ALK重排患者相比，EGFR突变患者的差异基因被更多的富集到免疫和细胞周期相关通路（图1D-E）。此外，通过GSEA分析发现TKI显著调控EGFR突变或ALK重排患者的免疫和细胞周期相关通路（图1F-G）。综上所述，研究者认为TKI治疗可能改变EGFR突变或ALK重排中TKI应答者的肿瘤微环境。
图1 TKI用药后的EGFR突变和ALK重排患者的转录组改变
3TKI治疗可重塑EGFR突变或ALK重排患者的肿瘤免疫微环境（TIM）
为了进一步验证TKI处理对TIM的影响，研究者基于xCell方法计算EGFR突变或ALK重排患者治疗前后免疫，微环境和和基质相关打分。TKI治疗后，不管是在EGFR突变还是ALK重排患者中，免疫打分、微环境打分和基质打分均显著升高(图2A-B)。此外，研究者还基于ssGSEA对TKI处理前后样本中16种细胞的浸润水平进行评估。其中， CD8 + T细胞、自然杀伤细胞(NK)等抗肿瘤活性细胞在TKI治疗后显著增加(图2C)。另外，多种免疫过程相关基因在TKI治疗后EGFR突变或ALK重排患者中发生表达上调（图2D）。然而，一些与抗原呈递相关的基因下调(如CALR、CANX和PDIA3，图2D)，这可能是在TKIs治疗后ALK重排应答者中T细胞浸润有限的原因。此外，研究者还发现在TKI治疗后的新抗原负荷和突变负荷减少（图2E-F），这可能导致ALK重排样本在TKI治疗期间抗原呈提递减弱并限制随后的T细胞抗肿瘤反应。
图2 TKI治疗可重塑EGFR突变或ALK重排患者的肿瘤免疫微环境
4TKI治疗前后体细胞突变的改变
EGFR突变或ALK重排患者的TKI耐药主要由获得性突变引起，但对应答后样本的体细胞突变还没有进行充分研究。因此，研究者对TKI治疗前后样本的体细胞突变进行分析，最终发现在TKI治疗后，多个个体的NEFH发生突变(图3A-C)。另外，在TCGA携带EGFR突变或ALK重排肺腺癌患者中，NEFH低表达患者有更长的总生存时间和无进展生存时间（图3D-E），表明NEFH是肺腺癌的促癌因子。
为研究NEFH突变与免疫之间的关系，研究者将TKI治疗前的baseline打分减去TKI治疗后的打分，最终得到免疫细胞的相对浸润评分。研究者发现NEFH突变患者的中性粒细胞丰度显著低于NEFH野生型样本(图3F)。另外，Spearman相关分析表明在EGFR 19Del/L858R突变或EML4-ALK融合的TCGA肺腺癌患者中，NEFH表达与中性粒细胞浸润呈正相关(图3G)。与治疗前样本相比，CXCL2等中性粒细胞趋化相关的基因在NEFH突变样本中的表达明显减少(图3H)。
综上所述，以上发现表明TKI抑制剂诱导NEFH发生功能缺陷突变，可能导致中性粒细胞浸润减少，预后更好。然而，细胞毒性细胞的相对水平未见明显变化，表明NEFH突变可能不是TKI处理后细胞毒性细胞浸润增加的主要原因(图3F)。
图3 TKI治疗前后体细胞突变的改变
5基于加权基因相关网络分析（WGCNA）识别TKI诱导免疫重构过程中的hub基因
为进一步探索TKI诱导的细胞毒性细胞渗透机制，研究者通过WGCNA分析识别TKI诱导免疫重构过程中的hub基因，基于样本中变异程度最高的5000个基因构建共表达网络，最终识别出9个不同的共表达模块 (图4A)。并对模块特征基因与样本临床特征(免疫评分、基质评分、微环境评分等)之间的关系进行探究，以识别与临床特征相关的共表达模块。研究者发现MEblue模块与免疫评分、微环境评分等呈显著正相关，而MEturquoise模块与TKI治疗和免疫评分呈显著负相关(图4B)。因此，研究者将重点放在这两个模块上，基于cytoHubba插件中提供的bottleneck方法分别识别出两个模块中的10个hub基因（图4C-D）。并计算免疫相关评分(IAS，MEblue模块中hub基因的平均表达量减去MEturquoise模块中hub基因的平均表达量)，Spearman相关性分析表明IAS与微环境评分（图4F）和多种免疫细胞类型存在较强相关性。
图4 基于WGCNA识别TKI诱导免疫重构过程中的hub基因
6 在TCGA和GSE11969数据中基于IAS打分的免疫相关亚型与免疫浸润、免疫活性和患者预后相关
接着研究者在携带EGFR突变或ALK融合的TCGA肺腺癌患者中基于以上过程中识别出的hub基因计算IAS打分，研究者发现IAS打分与细胞毒性细胞浸润和免疫评分相关(图5A-B)。为进一步评估IAS的预后价值，研究者将携带EGFR突变或ALK融合的TCGA肺腺癌患者基于IAS打分分为两组，其中IAS得分较高患者的预后显著优于较低患者 (图5C-D)。同样，在GSE11969数据集中，也可以观察到EGFR突变患者的IAS打分与免疫重构过程和患者生存时间显著相关(图5E-F)。
图5IAS打分与免疫亚型
最后让我们来回顾一下本文的主要内容：研究者主要对TKI在EGFR/ ALK阳性非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤免疫微环境中的作用进行探究，发现TKI可以通过诱导免疫微环境重构，激活肿瘤免疫响应过程。然后基于WGCNA识别TKI诱导免疫重构过程中发挥关键作用的hub基因并构建IAS打分，并进一步在公共数据集中基于IAS打分将样本划分为预后及免疫浸润程度不同的两个亚型。
今天的内容就是这些，本篇文章的一个很大优点在于有一手的自测数据，同时很好的结合了公共数据集中的测序数据与预后数据，从多方面论证TKI可以在EGFR/ ALK阳性患者中通过诱导免疫微环境重构，激活肿瘤免疫响应过程。非常值得同学们多多学习哦！
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