2、当你选择SYBRgreenreagents时，下面会出来一行选项includeMeltcurve,你把这项选中，就会做完实验以后用默认程序给你跑融解曲线了。
3、如拦纯帆果你还像修改融解曲线的设置参数，仍在左手边setup中选runmethod一栏简雹，进入参数设置，你想改哪个参数直接点击修改就可以了，但一定要确保读荧光的那个标志是在准确的位置亮裤悔的。
，是在DNA成倍增长的阶段。收集荧光信号的阶段就是dna成倍增长的时燃桐候。因为荧光染料会物段并结合在dna的大沟上面，所以当dna成倍出现时，染料的荧光信号也会成倍出现，此时就是收集荧光信号的时候。荧光定量 PCR 技术 ,是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光罩迹信 号积累实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法多子小瓜虫感染后草鱼TLR信号通路基因的表达动态2019-12-08农业科技
摘要：【目的】明确草鱼Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路基因在防御多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)感染过程中的免疫作用，为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考。【方法】以多子小瓜虫感染草鱼后，采用实时荧光定量PCR检测分析在不同时间点(感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d)草鱼部分TLRs基因(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88和TRIF)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮肤和脾脏中的表达动态变化。【结果】草鱼感染多子小瓜虫后，TLR1、TLR2、TLR9、TLR20和TLR21基因在皮肤和脾脏中的表达主要呈上调趋势，TLR4基因在皮肤中主要呈上调表达，在脾脏中则主要呈下调表达TLR信号通路接头蛋白基因MyD88和TRIF的表达变化趋势明显不同，其中，MyD88基因的表达在感染后第1～3 d均呈显著上调趋势(P<0.05，下同)，而TRIF基因的表达在整个试验过程中绝大多数时间点与对照组无显著差异(P>0.05)IRAK4和IRAK1在皮肤和脾脏中的表达也主要呈上调趋势，但在脾脏中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表达呈显著下调趋势IL-1β和TNF-α在绝大多数时间点均显著上调，但IFN的表达基本没有变化。【结论】草鱼TLR信号通路中的部分TLRs基因(TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及下游细胞因子(IL-1β和TNF-α)均参与防御多子小瓜虫感染的免疫反应，尤其是在感染早期和中期发挥关键作用。
关键词： 草鱼多子小瓜虫Toll样受体(TLR)信号通路基因表达
引言
【研究意义】Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)属于I型跨膜蛋白，是一类重要的模式识别受体，能特异性识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，并通过敏闹弯募集接头蛋白、转导信号及诱导炎性弯乱细胞因子等表达而发挥免疫防御作用，既是机体的第一道天然屏障，也是连接先天性免疫和获得性免疫的重要桥梁(何玉洁和潘建平，2017)。因此，研究TLR信号通路基因在病原感染桥闷过程中的表达动态，对揭示病原和鱼类间的免疫互作机制及制定有效的防控措施具有重要意义。【前人研究进展】依据接头蛋白的不同哺乳动物TLR信号通路可分为髓系分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)依赖型和β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR domain-containing adaptor-inducing IFN-β，TRIF)依赖型(Yuk and Jo，2011)。TLRs在识别相应的PAMPs后，除TLR3外，其他TLRs均以MyD88为接头蛋白，然后招募白细胞介素-1受体相关激酶4(IL-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4)和IRAK1，再将信号转导给肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)，TRAF6与转化生长因子β活化激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)及其结合蛋白(TAK1-binding proteins，TABs)TAB1和TAB2组合成复合物，从而激活下游的NF-κB和AP-1等转录因子，诱导免疫因子表达，最终启动免疫防御反应(Jiménez-Dalmaroni et al.，2016)。其中，TLR2和TLR4识别细菌的脂肽和脂多糖等TLR3识别病毒的双链RNATLR5识别细菌的鞭毛蛋白TLR7和TLR8识别病毒的单链RNATLR9识别非甲基化的CpG-DNA(Tan and Kagan，2017)。目前，有关TLRs与寄生虫感染的相关性研究仍较少，仅发现TLR2或TLR4可识别利什曼原虫(Leishmania major)(Bec-ker et al.，2003)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)(Debierre-Grockiego et al.，2007)和恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(Zhu et al.，2011)的糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定蛋白TLR9可识别克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)非甲基化的DNA(Bafica et al.，2006)TLR11能识别刚地弓形虫的Profilin-like蛋白(Yaro-vinsky et al.，2005)等。至今，已在哺乳动物中发现15种TLRs，而从鱼类中至少鉴定出20种TLRs(范泽军等，2015)。针对鱼类的研究主要集中在TLRs与细菌或病毒感染的相关性方面(Liao et al.，2017)。Li等(2011a，2011b，2012，2016)研究发现，斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的TLR2、TLR9、TLR21、MyD88及IRAK1等广泛参与抵御刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染的免疫反应，表明鱼类TLR信号通路基因在防御寄生虫的感染过程中发挥重要作用。【本研究切入点】多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)是一种广泛分布的纤毛类寄生性原虫，几乎可感染全部淡水鱼类，引起小瓜虫病(俗称白点病)，导致鱼类死亡或引起细菌、病毒等继发性感染，而造成巨大的经济损失(宋飞彪等，2012赵飞等，2012)。草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国最重要的水产养殖鱼类之一，约占淡水鱼总产量的20%，但草鱼养殖一直深受小瓜虫病困扰。早期研究发现，草鱼的TRAF6、TAK1、TAB1和TAB2及斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的TLR1、TLR2、TLR9和TLR21等TLR信号通路基因参与了抵御多子小瓜虫感染的免疫应答(Zhao et al.，2013a，2013b，2014)，但草鱼TLR信号通路其他基因是否参与并发挥防御多子小瓜虫感染作用等机理尚不清楚。【拟解决的关键问题】以多子小瓜虫感染草鱼后通过实时荧光定量PCR检测分析草鱼的部分TLRs(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白(MyD88和TRIF)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮肤和脾脏中的表达动态变化，明确草鱼TLR信号通路基因在防御多子小瓜虫感染过程中的免疫作用，为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
草鱼购自广东省佛山市某养殖场，健康活泼，规格整齐，体重约50 g/尾，在养殖过程中未感染过多子小瓜虫。随机挑取10尾草鱼，镜检鱼鳃和体表均未发现多子小瓜虫或其他寄生虫。草鱼在实验室内的循环流水养殖箱中暂养2周，氧气充足，水温控制在(23±1)℃，每日定时投喂商品饲料2次。多子小瓜虫从患病草鱼上分离获得，采用农业农村部渔用药物创制重点实验室建立的以斑点叉尾鮰为宿主的室内传代系统进行保种传代(Zhao et al.，2013a，2013b，2014)。
1. 2 多子小瓜虫幼虫准备
在多子小瓜虫传代过程中将体表已显现白点的斑点叉尾鮰置于5 L的塑料烧杯中，发育成熟的包囊将从鱼体上自动脱落，分别用孔径250和75 μm的网筛过滤、收集包囊。将包囊轻轻洗净后转入1 L的玻璃烧杯中，添加少量无菌水，23 ℃孵化20 h即发育成幼虫，再以孔径40 μm的网筛过滤，得到活体幼虫滤液。取10份10 μL的幼虫滤液，显微镜下观察计数，换算出总滤液中的多子小瓜虫活体幼虫数量，用于后续的草鱼感染试验。
1. 3 感染试验
将120尾草鱼随机平均分成感染组和对照组。感染组的60尾草鱼置于60 L的水桶中，按1∶10000的感染剂量加入多子小瓜虫活体幼虫进行体表感染，感染2 h后将草鱼转至250 L的鱼缸中。采用相同方法处理对照组的60尾草鱼，但不添加多子小瓜虫幼虫。于感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d时分别从感染组和对照组随机取样6尾草鱼。以灭菌刀片刮去草鱼背部中央的鳞片，使用尖头镊子剥离1.0 cm×1.5 cm大小的皮肤，轻轻刮除皮肤内侧肌肉以得到干净的背部皮肤，液氮速冻后-70 ℃保存备用。同时快速采集脾脏冻存备用。
1. 4 总RNA提取及cDNA合成
采用TRIzol试剂盒(Invitrogen公司)提取草鱼皮肤和脾脏组织的总RNA，以Nanodrop 1000微量紫外分光光度计(Thermo公司)和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。使用RNase-free DNase I(Fermentas公司)去除基因组DNA后，按ReverTra Ace@ Reverse Transcriptase试剂盒(TOYOBO公司)说明反转录合成cDNA，反应程序：42 ℃ 20 min99 ℃ 5 min4 ℃ 5 min。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存备用。
1. 5 目的基因片段克隆及测序分析
采用Beacon Designer 8.0设计草鱼TLR信号通路基因的特异性引物(表1)。以草鱼脾脏cDNA为模板进行目的基因PCR扩增，反应体系25.00 μL：cDNA模板1.00 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.00 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2.50 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.00 μL，rTaq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。扩增程序：95 ℃预变性2 min95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，进行35个循环72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用E.Z.N.A? Gel Extraction Kit(OMEGA公司)进行目的条带回收纯化，然后TA克隆至pMD18-T载体上，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。取100.00 μL菌液凃布于含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB培养基上，37 ℃培养过夜，挑选3个菌落PCR验证呈阳性的克隆送至广州艾基生物技术有限公司测序。
1. 6 实时荧光定量PCR检测分析
采用实时荧光定量PCR检测感染多子小瓜虫后草鱼皮肤和脾脏组织中TLR信号通路基因的表达动态，以每个时间点各组织的cDNA为模板、β-action为内参基因，在Roche LightCycler480 Real-time PCR Detection System上进行定量检测分析。反应体系10.00 μL：cDNA模板0.40 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.40 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5.00 μL，ddH2O 3.80 μL。每个样品均设3个重复。扩增程序：95 ℃预变性30 s95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，进行40个循环，每个循环结束时采集1次荧光信号。采用2-△△Ct法(Livak and Schmittgen，2001)计算目的基因的相对表达量，并以SPSS 22.0进行统计分析。
2 结果与分析
2. 1 感染多子小瓜虫后草鱼TLRs基因表达的动态变化
2. 1. 1 TLR1和TLR2基因的表达动态 草鱼感染多子小瓜虫后，其皮肤和脾脏的TLR1和TLR2基因表达主要呈上调趋势(表2)。在感染后第12 h，TLR1基因在皮肤中开始显著上调表达(P<0.05，下同)，是对照组的3.02倍，至感染后第1和2 d持续上调至对照组的5.38和6.31倍在脾脏中，TLR1基因在感染后第2和3 d时分别上调2.49和4.69倍，在其他时间点与对照组间无显著差异(P>0.05，下同)。TLR2与TLR1基因的表达变化相似，在皮肤中表现为感染后第1～3 d均显著上调，于感染后第3 d达峰值，为对照组的4.35倍在脾脏中表现为感染后第2和3 d显著高于对照组，分别是对照组的2.89和5.69倍。
2. 1. 2 TLR4基因的表达动态 草鱼感染多子小瓜虫后，TLR4基因在其皮肤和脾脏中的表达变化趋势不同(表2)。在皮肤中，TLR4基因在感染后第12 h上调为对照组的2.82倍，但至感染后第1 d回落到对照组水平，随后其表达又逐渐上调，于感染第3 d达峰值(4.55倍)。而在脾脏中，TLR4基因在感染后第12 h和第1 d的表达量显著下调，仅为对照组的35%和25%在其他时间点与对照组间均无显著差异。
2. 1. 3 TLR9基因的表达动态 草鱼感染多子小瓜虫后，其皮肤中的TLR9基因在感染后第2、3和7 d均呈显著上调表达，于感染后第3 d达峰值(3.35倍)而在脾脏中，TLR9基因除在感染第1 d显著上调2.45倍和感染后第3 d显著下调39%外，其他时间点与对照组间均无显著差异(表2)。
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