PCR扩增1829BP的片段，一对引物的Tm都是64度，退火温度已经试过55和50度都没有目的条带，请教pcr设置参数

首先，要确定引物设计成功了啊。

其次，确定试剂都是好的。

再次，确定模板DNA是没有降解太厉害。

还有就是PCR房间温度要控制在室温状态。

像这种夏天要要保持在25--30度室温。

以上都确定了之后，我建议你设计一下touchdown程序（每个循环降05度，这个具体程序你去查查，既可以减少非特异扩增，而且不用摸退火温度条件）。

你还可以摸摸温度梯度咯。这个程序就是那个Gradient选项（前提你的PCR仪是可以做温度梯度的PCR）。

如果所有的温度梯度都扩增不出来，我就倾向于是你的引物设计不好了。

一般退火温度越高，越不容易出现非特异，它对引物和模板的匹配要求很高。如果扩增不出来，可以考虑降低退火温度，这样虽然容易出现非特异片段，但是目的片段也相应容易扩增出来。

不知道是不是条带问题，如果是采用去条带补丁工具最好>

RT-PCR有许多影响因素，可能需要楼主提供更多具体的实验信息才能进行分析。

现在只能根据一般性的经验，尝试提供一些建议：

1 首先，RNA抽提到逆转录过程中是否都避免了RNase的污染，如果不是用DEPC水处理过的q头或EP管，很可能会导致RNase污染，就算这次抽提成功，但下次同样的 *** 作导致失败也是有可能的。另外逆转录时加入RNase抑制剂也是必要的。

2 其次，针对楼主现在遇到的问题，建议设置阴性阳性对照。具体来讲，你现在内参的有没有试过只加水的阴性对照，如果内参以水作为模板的阴性对照不能扩增得到产物，那说明内参的PCR体系没有问题，这样的内参PCR结果才有参考价值。而对于目的基因，有没有这个带有这个基因片段的质粒？如果有的话，将这个质粒作为阳性对照，如果阳性能够扩增，而逆转录的cDNA不能扩增，那就是cDNA模板问题；如果阳性质粒也扩增不到目的条带，那就是PCR体系或者程序的问题。

3 如果上述2项都注意到了，就需要注意PCR程序有没有问题。楼主在进行这个实验之前，有没有摸索过退火温度梯度？如果是比较难扩增的片段（比如使用简并引物扩增未知基因或者GC含量较高的目的基因），最好摸索一下PCR条件，主要是退火温度和延伸时间，如果没有阳性质粒，就只能浪费点cDNA了。

4 最后，也许可以尝试一下更换PCR试剂，如果实验室人很多的话，污染或造成试剂失活也是由可能的。实在不行，让实验室其他人员帮忙做做看，以我个人的经验看，人员的 *** 作经验也会影响成功率，毕竟需要注意的地方太多了。

1、PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则：引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

引物内部不应出现互补序列。两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

2、模板的制备

PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

最近玩游戏有时候会突然卡顿一下，你们有没有这个现象

偶尔有之。

第一步，打开电脑的独立显卡。

电脑的配置高低显卡占很大的比重，因为显卡是一个游戏能否运行的直接原因。每台电脑调节显卡的方法都不同，根据个人的电脑进行相应的设置。总之，应优先选择使用独显。

第二步，调整显卡显示效果。

选择图像预览的选项，进入后更改图形优先选择，可以看到改为性能后画质会变的很粗糙，又有很多的锯齿。

第三步，降低游戏的效果。

所有的游戏都有各种不同的画质上的要求，如果只要求流畅的运行游戏的话，那么就将游戏的画质降低，调低游戏画面的显示效果，然后调低分辨率即可改善卡顿现象。

第四步，窗口化运行游戏。

这是最有效的运行游戏的方法，将游戏窗口化运行大大降低了对电脑配置的要求，可以让电脑轻松运行大型游戏。

第五步，结束掉没用的进程和后台运行程序。

在运行游戏时要尽量将系统没用的进程结束掉，否则会影响运行速度，最好的方法直接使用360游戏模式更改，方便快捷。

电脑玩游戏会突然卡一下，一秒以后又好了，这是什么情况，谁知道怎么解决

出现这种情况有三种原因，一种是游戏自身的BUG，跟你电脑没什么关系，另外一种就是你的GPU(也就是图形处理器，简称显卡)处理能力跟不上，会出现掉帧、跳帧等情况。还有一种就是你的 *** 作系统有问题，可能一些不稳定的 *** 作系统会导致PC运行不稳定(比如说盗版WINDOWS)。看你的硬件配置是应该够了，但是特效记得不要全开，这样游戏会流畅一点。(建议下载WINDOWS优化大师进行优化)

玩游戏开始时流畅，中间会突然卡屏切换一下就好了怎么回事

开始时很流畅中间会中间的时候你有没注意是不是怪物 人 变多了或者周围的场景变复杂了如果有的话那就是内存不够，内存不够的时候一般遇到场景变复杂的时候会卡屏严重的时候卡一下卡一下的。如果游戏场景没变化，总是在玩一会后就卡屏的话就是显卡的原因 内存也有原因，而具体原因就是散热，众所周知玩游戏的时候CPU 内存 显卡都会随时间逐渐变热，而如果散热不够好的话 玩到一定时间的话 游戏过程中累积的一些内存 显存得不到及时释放就会变卡，有时连电脑都变的很卡。所以建议，你的显卡如果有风扇的话 把风扇清扫下 整个显卡清扫下，内存拔起来清扫下插槽重新插下，有时间的话最好整个电脑都用刷子扫下，夏天到了这个是必要的保养避免有时散热不及时零件会烧坏!!

为什么我玩游戏会突然卡一下

把游戏或者软件安装到其他分区，不要把c盘塞满/。关闭主题和桌面背景，最大限度增加系统性能。。把进程优先级设置为程序优先而不是后台服务优先。关闭不需要的开机启动项:开始>运行>输入"msconfig">启动选项卡>把不需要的统统去掉前面的"√"并重启系统游戏前右下角托盘内不需要的程序全都退出确保网络通常，关闭迅雷等下载工具更新下驱动程序(显卡、硬盘等)。。用windows优化大师或者内存管理大师释放压缩内存。用优化工具清理系统垃圾(注册表、冗余dll、不用的软件等)。。删除流氓软件和插件。。查杀病毒和木马等。游戏前关闭杀毒软件和防火墙。。必要时候恢复系统或者重做系统。。玩游戏推荐用windows xp，不要用vista(可以安装双系统)。。玩游戏前重启下计算机。。对硬盘进行优化(碎片整理、检测等)。。减低游戏画面分辨率，用窗口模式。。进入游戏设置为最高性能，关闭所有特效。。降低画质可以有效提升游戏性能(还是值得的哈)。。----------天牛啊。。要是你肯承担的风险的话可以试试超频来提升计算机硬件性能，超频就是增加硬件的运算频率，说的通俗点，可以把奔腾4变成酷睿，而不用换cpu。。这个需要对bios进行设置，难度不大，但是需要有一定的头脑o(∩_∩)o。。可以参考

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1、raid10就是由两个raid1组成raid0的级别，raid1需要两块磁盘，raid0也需要两块磁盘，所以raid10就需要四块磁盘，如下图先查看系统中磁盘信息。

2、先为四块磁盘创建分区，创建为fd类型分区，如下图，按照此方法把其它三块磁盘也进行分区。

3、分区完成在重新读取分区列表信息，如下图

4、然后通过mdadm 命令来创建两个raid1阵列，如下图，创建完成后可以通过-D命令来查看阵列信息。

5、创建两个raid1完成后，再使用mdadm命令来创建raid0，如下图

6、然后再格式化阵列信息并挂载阵列，就完成了。

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