代谢物广靶两批次种类差别大

广靶是相对定量，首先提取方法没有对单个代谢物进行方法优化，不能保证将样本中特定代谢物完全提取。第二，由于代谢物本身的理化特性，它们的离子化效率也不尽相同，导致最终检测时信号强度也不一样。比如A和B两个物质，同样拿1nmol的量用LC-MS分析，它们的信号响应值差异可能会很大，这就是物质本身灵敏度不同造成的，物质的检测灵敏度跟自身的化学性质有关，化学性质对物质检测灵敏度的影响主要表现在离子化效率和质谱碎裂行为两方面。因此对于不同代谢物之间不能进行加和或者比较。只有不同样本间的同一代谢物之间可以进行比较。

问题十二：关注的代谢物未检测到？

回答：1）核实该物质是否检测到，生信端核实CV>05过滤数据后，确实未有该物质；2）积分图的调取，确实无该物质；3）可再找对应研发询问，这个物种未检测到是否正常。

问题十三：All-sample-data表格中的数值怎么看呢，代谢物质的具体含量和单位是什么

回答：表中的数据看不习惯E您可以更改科学计数法来查看；这个数值是代谢物的相对含量，没有单位，是通过计算每个物质的特征离子在检测器形成的峰面积，（虽然不能定量物质的绝对含量，但检测条件一致，可用于比较同一物质在不同样本中的差异）。

问题十四：PLS-DA和OPLS-DA模型有什么区别？

回答：OPLS-DA比PLS-DA多了一个正交换算，把与模型分类不相干的信号过滤掉，因此OPLS-DA解释能力更强。比如组间差异比较小，组内差异比较大时，用PLS-DA的VIP筛选出的可能是组内差异变量，容易误导，而OPLS-DA则优于PLS-DA，可更准确地筛选出组间差异。

问题十五：KEGG通路中被注释到的差异代谢物个数之和，与KEGG被注释到的差异代谢物个数不一致？

回答：被KEGG注释到有C号，并不一定有通路，所以会有不一致。

主成分分析(PCA)和偏最小二乘法(PLS)是对变量数超过样本数量或变量之间存在多重共线性的组学数据进行可视化、回归、分类和特征选择的常用方法。

PLS和正交偏最小二乘法(OPLS)是有监督的模式，它们使用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样本类别之间的关系模型，实现对样品类别的预测，是一种建模类型的方法 相较而言，OPLS能够分别对相关因子和不相关变异进行建模，虽然计算方式与PLS相同，但OPLS具有更强的解释性。

而且，当无监督(PCA)无法很好地区分组间样本时，PLS-DA可以实现有效分离。并且PLS-DA和OPLS-DA所构建的分类预测模型，可进一步用于识别更多的样本类别，这是探索性的PCA方法无法做到的。

另外，PLS-DA和OPLS-DA所构建的分类模型中的载荷图可用于衡量各代谢物组分对样本分类判别的影响强度和解释能力，辅助标志代谢物的筛选。 ## 实例解读

OPLS-DA loading plots for different mulberry cultivars

该数据是通过液相色谱-高分辨率质谱(LC-HRMS)来研究年龄、体重指数(bmi)和性别对尿液中代谢物浓度的影响，是一个list具体包含：

由于目的是识别给定数据集的特征，而不是建模预测未知数据的分类，在这里将所有数据均作为训练集构建模型。

opls的计算结果中常用对象包括:

执行PLS统计建模时，一般会同时给出4个：

PLS-DA model of the gender response

显著性诊断(左上) ：实际和模拟模型的R2Y和Q2Y值经随机排列后的散点图，模型R2Y和Q2Y(散点)大于真实值时(横线)，表明产生过拟合 2 。

Inertia(惯量)柱形图(右上) ：通过展示累计解释率评估正交组分是否足够

离群点展示(左下) ：通过scoreMN和loadingMN计算出各样本在投影平面及正交平面的坐标，并标明相互差异较大的样本。

x-score plot(右下) ：各样本在PLS-DA轴中的坐标；R2X、R2Y等值展示在下方，用于评估模型优度：

与其说是可视化方法，不如称为数据提取章节。

通过变量投影重要度(Variable Importance for the Projection，VIP)，可以衡量各代谢物组分含量对样本分类判别的影响强度和解释能力，辅助标志代谢物的筛选(阈值通常设为1)。

Orthogonal partial least squares(OPLS) 将观测值矩阵X的差异分为两个部分：第一部分代表与Y相关的差异，第二部分代表与Y不相关（正交垂直）的差异，结果展示时需要结合起来讨论；由于OPLS区分了无关变量数据，从而使模型更加容易解读。

另外，OPLS可以更好地避免过拟合现象，预测性能优势并没有明显提升；因此，如果PLS-DA模型尚可：“summary”的4个plot的结果比较好，仍推荐使用PLS-DA。

执行OPLS后的数据提取，与PLS和PCA略有不同，需要同时考虑得分矩阵和正交矩阵。

过度拟合(Overfitting)是当机器学习应用于具有比样本更多变量的数据集的主要问题;前期随机数实验表明：当变量的数量超过样本的数量时，可以实现完美的PLS-DA分类。而，当样本数量超过观测的数量时，PLS过度拟合可能发生。因此，有必要通过标签的随机排列来检查模型的Q2Y值是否显著。

1 Li, H et al Abnormal expression of bHLH3 disrupts a flavonoid homeostasis network, causing differences in pigment composition among mulberry fruits Hortic Res 7 , 83 (2020)

2 Thevenot, E A, Roux, A, Xu, Y, Ezan, E & Junot, C Analysis of the human adult urinary metabolome variations with age, body mass index and gender by implementing a comprehensive workflow for univariate and opls statistical analyses Journal of Proteome Research 14 , 3322–3335 (2015)

3 Thévenot, E A, Roux, A, Xu, Y, Ezan, E & Junot, C Analysis of the human adult urinary metabolome variations with age, body mass index, and gender by implementing a comprehensive workflow for univariate and opls statistical analyses 14 , 3322–3335 (2015)

S7-200有两台PTO/PWM发生器，建立高速脉冲串或脉宽调节信号信号波形。一台发生器指定给数字输出点Q00，另一台发生器指定给数字输出点Q01。一个指定的特殊内存（SM）位置为每台发生器存储以下数据：一个控制字节（8位值）、一个脉冲计数值（一个不带符号的32位值）和一个周期和脉宽值（一个不带符号的16位值）。

PTO/PWM发生器和过程映像寄存器共用Q00和Q01。PTO或PWM功能在Q00或Q01位置现用时，PTO/PWM发生器控制输出，并禁止输出点的正常使用。输出信号波形不受过程映像寄存器状态、点强迫数值、执行立即输出指令的影响。PTO/PWM发生器非现用时，输出控制转交给过程映像寄存器。过程映像寄存器决定输出信号波形的初始和最终状态，使信号波形在高位或低位开始和结束。

注释：

在启用PTO或PWM *** 作之前，将用于Q00和Q01的过程映像寄存器设为0。

所有的控制位、周期、脉宽和脉冲计数值的默认值均为0。

PTO/PWM输出必须至少有10%的额定负载，才能完成从关闭至打开以及从打开至关闭的顺利转换。

文档光盘"提示与技巧"中的提示7、22、23、30和50包含使用PTO/PWM *** 作PLS指令的程序。

脉冲串（PTO）功能提供方波（50%占空比）输出或指定的脉冲数和指定的周期。脉宽调制（PWM）功能提供带变量占空比的固定周期输出。

每台PTO/PWM发生器有一个控制字节（8位），一个周期值和脉宽值（不带符号的16位值）和一个脉冲计值（不带符号的32位值）。这些值全部存储在特殊内存（SM）区域的指定位置。一旦设置这些特殊内存位的位置，选择所需的 *** 作后，执行脉冲输出指令（PLS）即启动 *** 作。该指令使S7-200读取SM位置，并为PTO/PWM发生器编程。

通过修改SM区域中（包括控制字节）要求的位置，您可以更改PTO或PWM的信号波形特征，然后执行PLS指令。

您可以在任意时间向控制字节（SM677或SM777）的PTO/PWM启用位写入零，禁用PTO或PWM信号波形的生成，然后执行PLS指令。

注释：所有控制位、周期、脉宽和脉冲计值的默认值均为零。

注释：PTO/PWM输出必须至少有10%的额定负载，才能完成从关闭至打开以及从打开至关闭的顺利转换

sPLS-DA（ Sparse PLS discriminant analysis ）是PLS-DA的一种特殊情况，同时包含变量选择和分类的过程。sPLS-DA允许变量选择，可以选择数据中最具预测性或判别性的特征，并帮助对样本进行分类。

PLS-DA模型建立在X中的所有基因上，其中许多可能无法提供信息来表征不同的类别。sPLS-DA分析的目的是识别出最能区分这两类的一小部分基因。

可以使用函数tunesplsda()评估选择的参数，包括sPLS-DA维度数量（ncomp）以及要在X数据集中选择的变量数量（keepX）。根据PLS-DA性能评估的建议，将ncomp的最大值设置为6。我们选择重复10次的5倍交叉验证(fold = 5)，并指定一个预测距离(最大距离)来预测所有CV运行中的类别隶属度。

对于 tune 函数中指定的所有 comp ，以最后一个 comp 为条件的每个 comp 的分类错误率如下所示。

sPLS-DA中包含的成分越多，分类错误率越低(预测精度越低越好)。将使得每个维度达到最佳性能的最优变量数表示为菱形。3个维度足以使我们最终的sPLS-DA模型达到最佳性能。

最终模型包括3个维度和前3个维度上的92830个选定变量

在前三个维度上的样本图(见下图)显示，第一个维度很好地分离了BL肿瘤，而第二个维度将EWB与NB和RMS区分开来。

第三个维度的加入则进一步区分了NB和RMS:

利用函数 auroc 也可以得到一个AUC图，用于PLS-DA分析。

第一个 AUROC 仅包括2个维度:

AUROC 包括所有维度。ROC和AUC标准对于我们方法的性能评价并不是特别有见地，但可以作为统计分析的补充。

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