目前最常用的第二代测序技术是哪一种

二代测序就是一种技术，不过测序原理分几种，一种是illumina的边合成边测序原理，目前使用最多，还有就是life的h离子转换ph的测序方法。

现有的技术平台主要包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Sol-exa GenomeAnalyzer、Helicos BioSciences公司的HeliScope™ Single Molecule Sequencer、美国Dana-her Motion公司推出的Polonator；

以及连接法测序 (sequencing by ligation)，即通过引物来定位核酸信息，技术平台有Applied Biosystems/SOLiD™ system。

扩展资料：

第二代测序技术的背景：

1、DNA测序技术：

长期以来，DNA测序技术一直是分子生物学相关研究中最常用的技术手段之一，从一定程度上推动了该领域的快速发展。人类基因组计划、转录组分析、微生物基因组重测序、单核苷酸的多态性 (single nucleotide polymorphisms,SNP) 分析等方面也促进的其他生物学领域的研究和发展。

每一代测序技术的更替都标志着生物学中基因芯片、数据分析、表面化学、生物工程等技术领域有了新的突破，从而应用在了测序领域，大大降低了测序成本，提高了测序效率，使测序向着高通量、低成本、高安全性和商业化的方向发展

2、第一代DNA测序：

尽管第一代 DNA 测序技术以其可达 1000 bp 的测序读长、99999% 的高准确性帮助人们完成了大量的测序工作，但其测试速度慢、成本高、通量低等方面的不足，也致使其不能得到大众化的应用。

随着科学技术的进步以及科研人员对测序技术的努力开发，2005 年 Roche 公司发布的 454 测序系统标志着测序技术跨人高通量并行测序的时代。

第二代 DNA 测序技术又称大量并行测序技术 (massive parallel sequencing,MPS)、高通量测序技术(high—throughput sequencing,HTS)，以低成本、99% 以上的准确度，1次可对几百、几千个样本的几十万至几百万条 DNA 分子同时进行快速测序分析。

这一时期的代表技术有 Roche 公司的 454、Illumina公司的 Solexa、ABI公司的SOLID，由于该时期的测序技术十分前沿，因而市场主要被这三家公司所垄断

包括Sanger测序，STR亲子鉴定、法医鉴定，SnaPshot测序技术，实时荧光定量PCR。
上个世纪末90年代，与“曼哈顿原子d计划”和“阿波罗登月计划”具有同样划时代意义的“人类基因组计划”启动，这是人类第一次在分子水平上全面地认识自我。随着人类基因组计划的开展，人们对基因与疾病的关系认识更加深入，有机会通过对基因缺陷的检测分析来判断各种疾病发生的风险，并由此衍生出一种新的健康服务项目—基因测序。
Sanger测序经过38年的发展已相当完善，成本也降低了10倍以上，现在国际上仍然是基因测序行业的金标准和主力军。sanger测序是目前所有基因测序的国际金标准，是包括荧光定量PCRTaqman探针法、普通PCR法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。
2010年以来，出现了很多新一代测序仪产品，新一代测序成本低、数据大、速度快，但都有待成熟，准确度不够高。
（一）、Sanger测序
被检测的DNA碱基顺序依次读出800bp以上，是一代所有测序和新一代所有测序的金标准。代表仪器美国ABI3730XL，Sanger测序一般医院很少开展，开展的都发公司做。耗时长达 13年之久的人类基因组计划也是依靠Sanger测序法才得以最终完成的。Sanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR 扩增直接测序。单个突变点的扩增（包括该位点在内的外显子部分片段的扩增），不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。所以单基因或部分基因控制的疾病样本检测，Sanger 测序可以发挥精准和成本低的优势。
（二）、STR亲子鉴定、法医鉴定
通过测定DNA片段的长度和颜色，来确定遗传关系。是sanger测序技术基础上，发展起来的一个技术，所用仪器与sanger测序所用仪器一样，检测原理一样，一台设备装两套检测软件，一台仪器具有三个功能。代表仪器美国ABI 3130、3130XL、3730仪器，一般司法机构和sanger测序公司拥有该仪器，医院没有。
亲子鉴定就是通过对DNA遗传片段检测，判定父母与子女之间的亲缘关系。
（三）、SnaPshot测序技术
SNaPshot技术是美国应用生物公司（ABI）开发，是荧光标记单碱基延伸的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP突变分型项目检测。通常用于10~30个SNP突变位点分析。是sanger测序技术基础上，发展起来的一个技术，和sanger测序仪器一样，检测原理一样，一台设备装有两套检测软件，一台仪器具有三个功能。代表仪器美国ABI3130、3130XL、3730仪器，一般sanger测序公司拥该有仪器。
优势：1、分型准确，2、通量高，3、检测速度快，4、不受SNP位点多态性特性限制，5、不受样本个数限制。SNaPshot技术是新一代测序技术（包括二代测序和芯片测序）SNP突变检测的金标准，sanger测序技术又是SNaPshot技术突变检测的金标准。
（四）、实时荧光定量PCR
利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线（或者与内参对照）对未知模板进行定量分析。代表仪器美国ABI 7500荧光定量PCR仪等，一般三甲医院都有该类仪器，普及较好。使用方便维护简单。1、突变寻找：定量PCR TaqMan探针杂交。2、基因定量：相对荧光定量PCR，医学上用来检测细菌或病毒RNA的表达量。荧光定量PCR是1996 年由美国ABI 公司推出的一种新定量实验技术。
实时荧光定量PCR应用领域：临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价，地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测，肿瘤标志物及瘤基因测序，遗传基因测序。

文章摘录： >目前最常用的是二代，首先两者原理不一样，目前二代有边合成边测序的illumina还有life的半导体芯片技术，三代主要是pacbio的；三代读长长可以达到kb级别但目前测序深度和数据量较低，二代读长短一般是75到300单端测序或双端测序最长到600，深度较深

随着高通量测序技术飞速发展，人们对微生物的认知也在逐渐深入。凌恩生物每天都会接到全国各类型微生物测序样本，上到山巅土壤，下至深海底泥；有老师研究植物根际和叶内微生物，也有老师关注动物昆虫肠道生理代谢的奥秘。为了得到能够研究的测序结果，规范标准的取样及送样是成功的前提。

在样本送测前，我们要注意以下几点：

1、取样使用的工具及容器必须经过灭菌处理；

2、取样后及时做好标记，记录取样相关信息；

3、样本送测前做好备份，防止意外发生丢失珍贵样本；

4、送测样本使用标准容器承装，在容器上标记清晰，送样不宜过多；

5、寄送时保持低温环境，建议使用干冰配送；

6、可使用凌恩微生态样本保真液，高品质样本是决定高品质研究成果的第一步。

常规土壤类样本取样方法-农田/森林/草原土壤等

(1) 取样方法

按实验设计确定采样范围，取样器具需事先消毒灭菌处理。采样时应去除地表杂质，根据需要挖取相应深度（如5~20 cm）的土壤，置于冰上运至实验室。去除可见杂质，建议过2 mm无菌筛网。同一样方多点样本等量混合均匀后取5~10 g，保存无菌EP管中，进行核酸提取，或-80℃保存备用。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司。

注：建议戴一次性手套、口罩，进行严格取样和 *** 作，尽可能减少人为的污染。

根际土壤样本取样方法-作物/蔬菜/草木根系等

（1）作物类（含草地等矮小植物）根际土壤取样方法

a 采集植物植株，去除根部大块土壤，置于冰上运输至实验室；

b 晃动根部，去除根部松散的土壤后，使用无菌刷子从根部收集残留土壤；

c 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。

（2）林木类根际土壤取样方法

a 采集地面下 10-20 cm 根际土壤，置于冰上运输至实验室；

b 过 2-5 mm 孔径无菌筛网；

c 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。

若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司提取。

注：取样器具请事先消毒灭菌处理。若为真菌根际土壤，请务必尽可能去除菌丝体残留，减少对 DNA/RNA 提取的干扰。

植物表面微生物取样方法

（1）取样方法

依据实验设计，进行样方设置，每一样方进行多点取样，同一样方点等量混匀成一个样本。植物根部组织可以通过摇晃振荡或无菌刷子去除根表粘附土壤。

（2）样本前处理

将植物组织浸没于无菌PBS溶液，180rpm孵育20min；取出植物组织，再次加入无菌PBS溶液，180rpm孵育20min，取出植物组织，再次加入无菌PBS溶液，超声波洗涤10min（参数：160 W，30s/30s），最后取出植物组织至于-80度冰箱保存备用。

将三次洗涤液汇总，过02um滤膜（或12000g离心10min，收集沉淀），收集滤膜至于-80度冰箱保存。

植物内部微生物取样方法

（1）依据实验设计，进行样方设置，每一样方进行多点取样，同一样方点等量混匀成一个样本。

（2）对植物组织进行表面消毒 *** 作或者使用上一步“ 植物表面微生物取样”中处理过的植物组织，液氮速冻后，研磨成粉，即可用来进行核酸的提取。

植物组织表面消毒具体 *** 作如下：

无菌水洗涤30s，70%无菌乙醇洗涤2min，2,5% NaClO（含01% Tween 80）浸泡5min后转移至70%无菌乙醇浸泡30s，最后使用无菌水洗涤植物组织3次，即视为对植物组织表面进行无菌化。

表面无菌化的植物组织至于-80度冰箱保存备用或进行核酸提取。

植物根表面微生物取样方法

（1）将所研究的物体放在事先灭好的无菌容器当中；

（2）加入PBS缓冲液后进行振荡，使得微生物从物体表面充分的脱落并聚集在PBS缓冲液当中,震荡至少2h以上；

（3）直接提取PBS缓冲液中的微生物或者将缓冲液用滤膜过滤之后再进行DNA的提取。

PBS浓度和PH有要求：浓度是用1x的，PH值是74，一般买回来的PBS是10x的，建议稀释到1x。

注意： 建议优先使用超声波洗涤 。

空气样本微生物取样方法

使用空气抽滤机，使空气通过 022 μm 滤膜，滤膜上有可见覆盖物（过滤时间越长，收集的空气中的灰尘越多，菌数量越多），收集完成后取下滤膜。滤膜置于冻存管中，液氮速冻，干冰寄送到实验室。

注意：由于样本特殊，微生物含量较少，建议多保管备份保存。

水体样本微生物取样方法

送样量：扩增子直径3-4cm滤膜1-2张；宏基因组直径3-4cm滤膜>=2张；

（1）研究目的进行确定水体的取样深度和范围；

（2）采样后进行滤膜过滤，选择合适孔径的滤膜，对于澄清水体或者略浑浊水体，选用022μm或者045μm的滤膜，取样体积大于5L；对于浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤；

（3）水体泥样的采集提供大于5g样本；

（4）用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。

注意：扩增子项目将2-3L水体过滤到1-2张滤膜（022或045um）后装入到离心管中；宏基因组项目将10L水体过滤到>=2张滤膜（022或045um）后装入到离心管中。

活性污泥与水体/地表沉积物类样本取样方法

（1）活性污泥

从活性污泥装置中取大于10 ml的悬浮污泥样本（约5-10 g沉降物），保存无菌EP管中，放入液氮或置于冰上，立即运至实验室进行核酸提取，或-80℃保存备用。

注：若液态污泥样本沉降物较少，可适当增加取样量。

（2）水体/地表沉积物

取距离水底/地表0-10 cm（具体按实验需要而定）的沉积物5~10 g，保存无菌取样袋或EP管中，置于冰上运送至实验室进行核酸提取，或-80℃保存备用。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司提取。

微生物在地球上无处不在，从陆地到海洋，从衣物到皮肤，甚至我们的身体内部。

繁衍、变异、自然选择和生存斗争，是所有生物必须经历的。

因为生命的第一要义，是生存。

为了生存，必须斗争，生物之间为了争夺资源，以及生物与自然环境之间，都存在着斗争 ，在这个过程中，有些微生物能够与人类和平共处，甚至互利共生，而有的微生物则会使人患病，通常有细菌、真菌、病毒、支原体，以及衣原体，这些就是临床上的病原微生物。

自然选择需要经历漫长的过程，但是近年来环境污染，药物滥用，加快了病原微生物的进化速度，耐药菌，超级菌的出现，严重威胁着人类健康。

还有一些微生物，本来与人类没有交集，原先只存在于自然界，而有人为了猎奇，食用野生动物，从而把这些动物身上携带的病毒带到了人类社会，如本世纪初的非典病毒（Severe Acute Respiratory Syndromes, SARS）就是例子，这类新型病毒对公共卫生健康形成了巨大的挑战，个别人的贪婪，给全世界的人们带来了巨大的灾难。

当健康受到了威胁，对付细菌，人类发明了抗生素， 对付病毒，发明了抗病毒药物，但要如何治疗，第一步是找出元凶，而这在临床上往往存在困难。

传统的血常规，或者器官和组织的影像学指标能够判断感染的可能性，但并不能作为确诊的依据，比如血常规只能告诉你是否有细菌或病毒感染，但不能告诉你是什么细菌或病毒，还需要进一步检查才能确诊，以便对症下药。

实验室检查，如抗原检测、核酸检测、代谢产物检测以及毒素检测才是明确感染、指导治疗和判断预后的重要手段。

为了克服传统方法的不足，下一代测序技术（Next-generation sequencing technology，NGS）在病原微生物检测中的应用具有非常大的优势，如：

当然，NGS的缺点也是有的：

即便有不足，但NGS的技术优势更为明显，在疑难微生物，以及难以培养甚至无法分离培养的少见菌属的鉴定，特别是新型病原微生物的暴发流行监测方面，NGS快速、准确和高分辨率的特点，使其成为病毒鉴定的金标准，在流行病学分型中发挥着重要作用。

新型冠状病毒（Corona Virus Disease 2019, COVID-19）正肆虐全球，目前尚无疫苗和特效药，人们除了戴口罩，注意个人卫生以及增加社交距离外别无他法，面对汹涌的疫情，再一次提醒人类，要放下自己是万物之灵的傲慢，因为微生物才是当之无愧的地球之王，它们在这个星球上生存的历史比人类更长，种类和数量也比人类要多得多。

我们不能，也不应该试图消灭所有微生物。我们之间的关系，不只有对抗，还有合作，但是当我们的健康受到威胁时，也要勇于斗争。

物竞天择，适者生存，人类与微生物的合作与斗争，必将永远进行下去。

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