【线粒体-临床 IF2.456】肌酸，辅酶Q10和硫辛酸对线粒体疾病的有益作用

Beneficial effects of creatine, CoQ10, and lipoic acid in mitochondrial disorders

肌苷，辅酶Q10和硫辛酸对线粒体疾病的有益作用

作 者M Christine Rodriguez;Jay R MacDonald;Douglas J Mahoney;Gianni Parise;M Flint Beal;Mark A Tarnopolsky

刊 名Muscle & nerve

出版日期2007

卷 号Vol35

页 码235-242

doi101002/mus20688

影响因子2456（2007）  2283（2015）

摘要： 线粒体疾病具有共同的细胞后果：（1）ATP产生减少；（2）增加对替代厌氧能源的依赖；（3）增加活性氧的产生。本研究的目的是确定联合治疗的效果（肌酸一水合物，辅酶Q 10，以及针对上述细胞后果的硫辛酸，使用线粒体细胞病患者的随机，双盲，安慰剂对照，交叉研究设计，针对多个结果变量。 3例患有线粒体脑病，乳酸性酸中毒和中风样发作（MELAS），4例存在线粒体DNA缺失（3例慢性进行性眼外肌麻痹患者和1例Kearns-Sayre综合征患者），还有9例其他非线粒体疾病分为前两组。 联合疗法可降低所有患者组的静息血浆乳酸和尿8-异前列腺素，并减轻峰值踝背屈强度的下降，而仅MELAS组观察到较高的无脂肪量。一起，这些结果表明，针对线粒体功能障碍的多个最终共同途径的联合疗法可有利地影响细胞能量功能障碍的替代标志物。将来需要在相对均一的人群中进行更大样本量的研究，以确定这种联合疗法是否影响功能和生活质量。

线粒体疾病代表一组影响线粒体能量传导的疾病，其特征是临床，生化和遗传异质性。 18 尽管表型表达差异很大，但大多数患者合并有乳酸性酸中毒，中风或癫痫发作，头痛，色素性视网膜炎，上睑下垂，运动耐力低下，眼肌麻痹，心肌病，神经病和视力减退。 16 ， 29 ， 38

线粒体功能障碍导致许多细胞后果，包括：（1）ATP生成减少；（2）增加对替代厌氧能源的依赖；（3）增加活性氧（ROS）的产生。 16 ， 37 没有疗效的治疗线粒体疾病，大多数策略的目的是为了缓解上述蜂窝后果。 16 ， 18 上的患者的线粒体疾病的治疗策略的报告已经检查的单一化合物的效果，如辅酶Q 10（辅酶Q 10） 2 ， 4 ， 21 或肌酸（CRM）。 13 ，  14 ，  38 基于的概念，即线粒体功能障碍导致一些细胞的病理生理学后果，  33个 为线粒体疾病大多数治疗策略具有相对于单一疗法使用的联合治疗（或治疗“鸡尾酒”）。某些研究已经评估了针对上述三种方法中的一种以上的联合疗法的疗效。然而，这些是任何一种情况下报告，  8 ，  25次 开放试验中，  1 ，  19 ，  20 ，  27 ，  32 或回顾性研究。 26

基于线粒体疾病人体试验的潜在功效证据或人体试验或体外研究的证据显示拟议的化合物可以缓解线粒体功能障碍的一种或多种最终常见途径，我们建议评估联合用药的潜在疗效下列化合物：（1）CrM（替代能源 36 和抗氧化剂 30 ）； （2）α-硫辛酸（抗氧化剂 17 和可增加CrM的吸收 6 ） ；（3）辅酶Q 10 [作为抗氧化剂 21 并绕过电子传输链（ETC） 19的配合 物I ]。我们在这里报告了一项随机，双盲，安慰剂对照，交叉试验的结果，该试验研究了这种靶向联合治疗性鸡尾酒联合CrM，CoQ 10和α-硫辛酸对线粒体细胞病变患者的影响。

患者： 从麦克马斯特大学的神经肌肉和神经代谢诊所招募了17位具有明确或可能的线粒体疾病的患者。结合临床症状，空腹血清乳酸浓度，肌肉活检结果（红色的纤维状或细胞色素 c 氧化酶阴性纤维）和线粒体DNA（mtDNA）分析。仅8、9和13号患者未鉴定出DNA突变，对于线粒体神经胃肠道脑病的患者，仅进行确认试验（胸苷升高，胸苷磷酸化酶活性降低）；然而，他们的乳酸浓度升高，组织学异常，运动耐力低下，有氧能力低，被认为具有“可能的线粒体细胞病变”。一名患者由于个人原因未完成研究的一部分；因此，该患者的数据被排除在分析之外。最终分析基于16位患者（10位女性和6位男性），根据他们的诊断分为三组。表中显示了患者人群的特征 1 。 第一组包括三位线粒体脑病，乳酸性酸中毒和中风样发作的患者（MELAS组）。第二组包括三名被诊断为慢性进行性眼外肌麻痹（CPEO）的患者和一名被诊断为Kearns-Sayre综合征（KSS）的患者，所有患者均在肌肉来源的mtDNA中被检测出缺失（CPEO / KSS组）。第三组包括各种线粒体疾病的患者：六名线粒体细胞病变患者，两名Leber遗传性视神经病变患者和一名线粒体神经胃肠道脑病患者（其他组） 。该研究获得了我们机构伦理委员会的道德批准，所有患者均提供了知情的书面同意。

CPEO，慢性进行性眼外肌麻痹；细胞病变，线粒体细胞病变；KSS，Kearns–Sayre综合征；LHON，Leber的遗传性视神经病变；MELAS，线粒体脑病，乳酸性酸中毒和中风样发作；MNGIE，线粒体神经胃肠道脑病（无胸苷磷酸化酶活性，胸腺嘧啶核苷水平高）。

设计/干预。

患者参加了一项随机，双盲，安慰剂对照，交叉研究，其中每个参与者均接受了2个月的治疗和安慰剂治疗，两次试验之间有5周的清除期。治疗阶段包括3 g CrM + 2 g葡萄糖+调味剂（新碱；加利福尼亚州帕洛阿尔托的Avicena），300 mgα-硫辛酸（Tishcon，Westbury，纽约）和120 mg CoQ 10（Qgel； Tishcon）每天的0：900和21:00。在安慰剂阶段，将外观相同，品尝相同的粉末（5 g葡萄糖+调味剂； Avicena）和凝胶胶囊（大豆油； Tishcon）用作安慰剂。

禁食4小时后，两个试验的患者在大约每天同一时间（2-3小时内）在每个干预阶段之前和之后完成测试。

测量。

仅在首次访问时记录参与者的身高和体重。所有其他访视均采取了其他所有结果指标。参与者使用定制的力传感器设备进行了握力，踝背屈（关节角度为90°）和膝盖伸展强度测试，数据已直接输入包含数据采集和分析软件的计算机中，如前所述。 38 对于所有力量测量，参与者都在右侧进行测试，并根据手的大小进行个性化设置，并在每次访问之间保持恒定。为了达到峰值强度，参与者进行了3个5s试验，相隔约30 s。记录具有最佳结果的试验值。参与者还进行了1分钟的等距握力和踝背屈疲劳测试（9秒钟工作时间：1秒钟休息周期）。使用肺活量计（Koko； PDS Instrumentation，路易斯维尔，科罗拉多州）进行肺功能测试，包括1秒内的强制肺活量和强制呼气量。每位患者每次访视均至少完成两次肺活量测定，以确保该值与他们的首次尝试一致。进行生物电阻抗（Prism BIA 101A； RJL Systems，Clinton Twp，密歇根州）以确定身体成分。

静脉血液采样和尿液采集。

从肘前静脉将全血收集到预先冷却的，装有肝素（用于乳酸分析）或EDTA（用于测定CoQ 10）的真空管中，并以2500 rpm离心10分钟。将血浆储存在-80℃。每位患者都提供了尿液样本样品，将其约10 ml快速冷冻并保存在-80°C下用于肌酸，肌酐，8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OHdG）和8-异前列腺素的后续分析（ 8-IsoP）。

乳酸

使用YSI 2300 Stat Plus乳酸分析仪（YSI，Yellow Springs，俄亥俄州）测定血浆乳酸浓度。乳酸的批内和批内变异系数分别为21％和17％。

辅酶Q 10。

使用电化学检测器通过高效液相色谱（HPLC）测定血浆CoQ 10浓度。将血浆（05 ml）等分到装有1 ml 1-丙醇和05 ml辅酶Q 9的10 ml真空容器中，混合5分钟，然后在300  g下 离心5分钟。使用022μM注射器过滤器过滤样品，然后将其转移到色谱瓶中，以进行HPLC直接分析。将辅酶Q 9添加到混合物中以作为内标，作为辅酶Q 9的水平在人体血液中微不足道。将所得样品注入装有3μm填料的反相不锈钢色谱柱（150×3 mm）RP‐C18中，该色谱柱带有一个电化学检测器（ESA，贝德福德，马萨诸塞州），该检测器连接到带有单个电极的保卫室（5020型） ； E = +350 mV）和带有双电极的库仑分析池（5011型； E1 = -400 mV，E2 = +300 mV）。使用混合和脱气的甲醇，1-丙醇和乙醇（70:20:10）的流动相，其中含有50 mM乙酸锂作为电导盐，流速为05 ml / min，总运行时间少于15分钟 首先通过还原泛醌（E = -400 mV），然后氧化所得泛醇（E = +300 mV）测量辅酶Q 10。辅酶Q 10和辅酶Q 10 H 2在最后一个电极上以最高灵敏度检测到。标准曲线的相关系数为0997。变异系数确定为<2％。

肌酸和肌酐。

使用HPLC测定尿液中的肌酸浓度，肌酐和肌酸：肌酐的比例。将尿液（1 ml）等分到微量离心管中，并以10,000 rpm离心10分钟。使用ddH 2 O 将尿液上清液稀释至十分之一稀释（01 ml上清液至09 ml ddH 2O）。使用冷藏自动进样器将稀释的尿液上清液保持在10°C。使用Hewlett Packard LC1100系列HPLC（Agilent，Mississauga，Ontario），将紫外检测器设置为λ= 210 nm，将样品注入250×46 mm C18 Phenomenex10-μHydro-RP 80色谱柱中。Hewlett Packard LC1100数据分析程序会生成校准曲线并分析所得数据。流动相是使用氢氧化钾以10 ml / min的流速将磷酸二氢钾（20 mM）调节至pH 50。变异系数为31％。

8-IsoP。

按照制造商的说明，使用商业酶联免疫吸附测定法（MediCorp，蒙特利尔，魁北克）测定尿中的8-IsoP浓度。标准曲线的相关系数为0988。变异系数为105％。8-IsoP值相对于肌酐（g）表示。

8-OHdG。

如前所述，使用HPLC测定尿液中8-OHdG的浓度。 3  8-OHdG值相对于肌酐（g）表示。

统计。

使用三向（组×处理×时间）或双向（组×处理）重复测量方差分析（ANOVA）进行统计分析。鉴于先前的假设，即由于三种成分中的每一种都具有抗氧化特性，因此联合疗法可减少乳酸盐并降低氧化应激，我们对氧化应激标志物使用了单尾检验。当发现重要结果时，将运行Tukey HSD事后测试。所有分析均使用Statistica v。5软件（StatSoft，Tulsa，俄克拉荷马州）进行。 P  <005的值被认为具有统计学意义。所有数据均以平均值±SD给出。

辅酶Q 10和肌酸：肌酸酐。

如预期的那样，与安慰剂阶段相比，联合治疗的血浆辅酶Q 10和尿肌酸：肌酐的比率明显更高。联合治疗后（194±089μg/ ml）的血浆CoQ 10浓度比安慰剂（071±024μg/ ml）高172％（ P  <005;  n  = 14），肌酸：肌酐比高600％ （245±208）比安慰剂（035±020）（ P <005）。

血浆乳酸盐。

在血浆乳酸中发现显着的治疗×时间相互作用（ P  <005，单尾），在联合治疗阶段血浆乳酸浓度较低，在安慰剂阶段未观察到效果（图 1 ）。
  P  <005，单尾。COMB，联合疗法；CPEO，慢性进行性眼外肌麻痹；KSS，Kearns–Sayre综合征；MELAS，线粒体脑病，乳酸性酸中毒和中风样发作。黑柱，联合疗法；开列，安慰剂。

观察到FFM，TBW和％BF的显着三向相互作用（组×治疗×时间）（ P  <005）（图 2 ），FFM和TBW升高，％BF降低仅对MELAS集团。
（A） 三组中每个治疗阶段之前和之后的无脂质量（FFM）， （B） 全身水（TBW）和 （C） 身体脂肪百分比（％BF）。  P  <005；  P  <005，单尾。COMB，联合疗法；CPEO，慢性进行性眼外肌麻痹；KSS，Kearns–Sayre综合征；MELAS，线粒体脑病，乳酸性酸中毒和中风样发作。黑柱，联合疗法；开列，安慰剂。

肺功能。

在1 s内未观察到治疗，组或时间对强制肺活量或强制呼气量的影响（表 2 ）。

表2 肺功能（ n  = 11）。

CPEO，慢性进行性眼外肌麻痹；FEV 1，用力呼气量1 s；FVC，强制肺活量；KSS，Kearns–Sayre综合征；MELAS，线粒体脑病，乳酸性酸中毒和中风样发作。

强度措施。

尽管对于每个阶段的结束，无论采用何种治疗方法，峰值握力都降低的趋势不明显（ P  = 0054），但对于峰值握力的处理，组别或时间均无影响。对于握把或脚踝背屈疲劳（表示为峰值疲劳或区域疲劳）或峰值伸膝力量，也没有任何治疗，组或时间效应。但是，观察到踝背屈峰值强度存在显着的双向相互作用（治疗×时间），安慰剂后，踝背屈峰值强度显着下降（从3116±1368 Nm降至2906±1331 Nm），但未观察到组合治疗（从2932±1378 Nm到2931±1205 Nm）（ P <005， n  = 16）。

尿液8-OHdG和8-IsoP。

尿8-OHdG没有治疗或组作用；然而，与安慰剂相比，联合治疗后降低8-OHdG /肌酐的趋势无统计学意义（分别为3,47205±1,88306 ng / g肌酐与4,165±1,98500 ng / g肌酐； P  = 0065）。观察到8-IsoP的治疗效果，因此与安慰剂相比较，联合治疗后观察到较低的尿8-IsoP /肌酐含量（分别为6,57247±3,35664 ng / g肌酐与7,46343±3,15523 ng / g肌酐。 ； P ＜005）。

CrM，CoQ 10和硫辛酸 的联合治疗 可降低静息乳酸浓度，防止峰值踝背屈强度降低和氧化应激降低，这可通过尿中8-IsoP排泄和尿液的显着减少来体现。 所有组中8-OHdG排泄的方向性趋势。此外，在MELAS组中，患者的身体成分发生了积极变化（FFM和TBW增加，％BF降低）。联合疗法对肺功能，峰值握力或膝盖伸展力量，或握力或脚踝背屈百分比或区域疲劳没有影响。

从突变线粒体疾病的结果导致在氧化磷酸化的缺陷，导致在nonaerobic能源的依赖性增加 16 ， 38 和一个升高的血浆乳酸浓度。 16 ， 29 ， 38 无论是磷酸肌酸（PCR）系统，腺苷酸激酶/ AMP脱氨酶，或糖酵解/糖原分解可以被用来提供ATP; 但是，由于对糖酵解/糖酵解的依赖性增加，导致乳酸升高 38 CrM被包括在本研究中用于增强PCr系统的联合治疗中。联合治疗后尿肌酸：肌酐的升高和血浆乳酸浓度的降低间接表明联合治疗中的CrM成分可能为肌肉收缩提供了另一种厌氧能源。

从线粒体疾病患者的肌肉中观察到总肌酸 36 和PCr  14的 水平较低，进一步支持了在此类患者中补充CrM的潜在益处。Kornblum等人的最新研究。 14 研究了补充CrM对CPEO或KSS患者肌内PCr的影响。相反，先前在健康受试者中，观察到的结果 6 ， 11 没有导致CrM工作在补充尽管肌酸的血浆浓度显著随着由磷- 31核磁共振光谱法测量增加肌内肌酸浓度。 14 当前研究的局限性在于未在大脑或骨骼肌中测量肌酸或PCr含量。然而，伯克等。 6 表明，在健康志愿者中，将CrM与硫辛酸联合使用时，肌肉PCr和总肌酸浓度显着高于单独补充CrM时。 因此，硫辛酸在我们的患者中可能会增加CrM的摄取，从而导致观察到的静息血浆乳酸浓度降低。

乳酸浓度较低的另一种或其他解释可能是联合治疗改善了线粒体ATP的产生。辅酶Q 10是ETC中的电子受体，它将电子从络合物I和II转移到络合物III。 16 ， 18 ， 33 的CoQ的目标10的补充是旁路缺陷在ETC最大化ATP产生。 16 一项使用来自线粒体细胞病变患者的培养淋巴细胞的研究发现，结合CoQ 10的联合疗法可增加线粒体ATP的产生，其中约49％归因于CoQ 10。 19 相比之下，人类研究的结果不是决定性的，对于一些报道报道辅酶Q的有益效果10在降低血浆休息乳酸浓度患者的线粒体疾病， 1 ， 2 ，而另一些则没有。 19 ， 20 ， 38 不同于以往的报道中，病人在我们的研究也给予硫辛酸。 硫辛酸天然存在于线粒体内，是丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶的重要辅助因子。 33 硫辛酸用作有效的抗氧化剂 31 ， 33 ，并且降低氧化应激在健康志愿者的标记。 17 硫辛酸对ROS的清除作用增加，可能会减慢线粒体疾病中的“恶性循环”，在这种情况下，ROS的产生会导致mtDNA突变，从而加剧氧化磷酸化的缺陷，从而导致更多的ROS产生 。 16 因此， 辅酶Q 10与硫辛酸结合使用，可能具有增加ATP产生的能力，从而导致替代能源的利用率下降，血浆血浆乳酸浓度降低。

安慰剂治疗后，联合疗法减轻了峰值踝背屈强度的下降。据推测，在联合治疗CRM的成分会导致与安慰剂相比改进的强度值，如CRM有被证实可以改善患者强度与线粒体疾病 35 ， 38 或杜氏肌营养不良症， 34 和中老年健康志愿者。 5 鉴于我们没有直接测量肌肉中的肌酸或PCr含量，因此我们不能得出结论说联合疗法中的CrM成分会导致踝背屈峰值强度下降。其他研究表明，使用CoQ可以改善线粒体疾病患者的强度10补充。 4 ， 9

先前的研究表明，补充CrM可以改善人体成分。 5 ， 34 的MELAS组在体本研究中证实的改善的组合物，增加FFM和TBW，和降低的％BF-以下组合疗法; 但是，CPEO / KSS或其他组的患者未见这些改善。与本研究其他两组中代表的其他形式的线粒体疾病患者相比，MELAS患者表现出更严重的临床表型。因此，患有MELAS的患者在本研究中测量的所有变量（包括身体组成）方面都有更大的改善空间。

高水平的ROS和氧化应激与线粒体疾病的病理生理有关。氧化应激的更高水平已报告患者的线粒体疾病与对照组相比 21 ， 39 和患者的线粒体DNA突变更高程度的异质性。 7 联合疗法中的所有三种化合物均具有降低氧化应激的特性。 肌酸在无细胞系统中具有直接的抗氧化特性 15， 并为与多种氧化剂孵育的哺乳动物细胞提供细胞保护作用。 30 辅酶Q 10充当脂质的抗氧化剂和线粒体膜 10 ， 33 并且还可以通过绕过氧化磷酸化中的缺陷来减少ETC的电子泄漏。 10 最后， 补充硫辛酸后，健康志愿者的尿中异前列腺素水平较低 。 17 我们观察到，与安慰剂相比，联合治疗后的8-IsoP浓度更低；但是，仅观察到了8-OHdG含量降低的趋势。异前列腺素是由花生四烯酸的过氧化作用形成的类似于前列腺素的化合物。 22  -  24 它们是化学稳定的，在体内形成的，并且是一个过氧化特异性产物可检测在稳态水平在多种人类组织和体液中的 24 ;  所有这些特征都使8-IsoP被认为是评估体内氧化应激的最可靠标记。 23 ， 24 的8-OHdG由鸟苷残基的羟基化形成，并且经常被用来作为对DNA损伤ROS的生物标志物。 28 ， 39 由于的8-OHdG是用于向所有的DNA，不仅线粒体DNA的氧化损伤的生物标记物，它是可能的核DNA的存在可能掩盖或稀释用于降低氧化性损伤的mtDNA的联合治疗的有益效果。

很少有随机对照试验检查了营养药物在线粒体疾病患者中的作用。那些已经进行了严格的检查，单一化合物的唯一的效果，如CRM的 12 ， 13 ， 38 或辅酶Q 10， 9 已审查。其他的研究，审查的联合治疗效果 1 ， 19 ， 20 ， 26 ， 27 ， 32 没有使用与我们的研究相同的严格研究设计。结果，与这些研究进行直接比较非常困难，特别是当结合不同线粒体疾病人群中检查了不同的化合物，组合和结果指标这一事实时。考虑到几乎无限的组合，在将来进行临床试验评估之前，必须采用多种筛选方法，基于合理的首要原则测试潜在疗法。方法论，例如使用转基因动物模型或杂种动物，可能被证明可用于评估“线粒体混合物”中目前使用的十几种化合物的许多潜在组合。

我们的结果表明，与安慰剂相比， 针对线粒体功能障碍的三种后果的CrM，CoQ 10和硫辛酸的联合疗法可改善静息血浆乳酸浓度，身体成分，踝背屈强度和氧化应激。 但是，由于一个患者组比其他患者具有更大的获益 （MELAS> CPEO / KSS =其他） ，因此一种治疗策略可能并不普遍适用于所有线粒体疾病。

这项研究由沃伦·拉默特（Warren Lammert）及其家人慷慨捐赠。辅助酶Q 10和硫辛酸由Tishcon捐赠，肌酸一水合物由Avicena捐赠。

8-IsoP，8-异前列腺素; 8-OHdG，8-羟基-2'-脱氧鸟苷; ％BF，身体脂肪百分比；辅酶Q 10，辅酶Q 10 ; CPEO，慢性进行性眼外肌麻痹；CrM，肌酸一水合物；ETC，电子传输链；FFM，无脂肪物质；HPLC高效液相色谱；KSS，Kearns–Sayre综合征；MELAS，线粒体脑病，乳酸性酸中毒和中风样发作；mtDNA，线粒体DNA；PCr，磷酸肌酸；ROS，活性氧；TBW，全身水

略

在某些需要特长时延及高稳定度场合时，唯有让贤给超声波延迟线。从基本物理学中得知，超声波在固体及液体中传播速度约3千米/ 秒，相对比起电波在导体中慢，基于这原理，把电讯等转变成机械振动让其通过（例如玻璃及在另一端把机械振动转变圆电讯号），如此可以得到较长昀延迟时间。把电讯号输入石英或其他压电元件昀换能器使得变成机械振动，因换能器是紧密和玻璃耦台，所以振动波就传入玻璃棒中，在玻璃棒的另一端运用同类换能器将接收到机械波变回电讯号。值得一提的就是在PAL彩色电视系统内所采用超声波延迟线其精确度要求极高，在延迟时间63943μS内变动率应>0003μS。假如是采用普通玻璃则受温度影响较大，故需采用ISOPAUSTIC的玻璃来减低温度所引起昀影响。我们在研究PAL彩色电视的超声波延迟特性时，常能接触到工作频率、通频宽度、输入损失等数据，现在一起来研究一下。工作频率：PAL彩色电视中R-Y、B-Y在放送时被调在4433619Hz，为了令PAL延迟系统分裂U及V两分量时不产生畸变，换能器的自然频率必须和载波一致。频宽：彩色鲜艳度除了有赖于色讯放大器及PAL延迟线激励电路的宽频外，最后取决于超声波延迟线的频宽，频宽由换能器品质决定及与玻璃棒耦合时的厚度有关。输入损失：电讯通过任何无源元件都有功率损失，这是大家所能理解的，超声波时延线也不能例外，损失多少由换能器和玻璃棒的品质及结构而定，应用中也要留意换能器本身具有一定潜布电容，如需详细全面研究可参考厂家供给等效电路。初期设计的棒状超声波延迟线体积稍长，为了缩短其长度常采V形传导反射式、M形传导反射式及五次传导反对式的改良延迟线，并精密磨控其长度，可准确获得所需时延。

服务器错误。
上游服务器错误意思是指上游服务器产生了错误的意思，也是表明针对自己的一些想法或者自己的判断，认为这件事情可能存在一些问题，并不是正常运行的一种状况的意思，所以针对这些事情，自己明确提出出自己的一些看法，认为这件事情可能也是需要做出改变的，所以上游服务器是存在着明确错误的。

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