ATAC-seq(1) -- 实验原理

染色质关闭：压缩DNA

这个过程像我们将文件压缩为zip或者rar的压缩包，减少它的占用空间。

染色质开放：解压DNA

这个过程类似于我们要查看刚刚压缩包里的文件，我们需要解压后才能查看到文件里的内容。

ATAC-seq，全称Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing，是2013年由斯坦福大学William J Greenleaf和Howard Y Chang实验室开发的用来研究染色质可及性（通常也理解为染色质的开放性）的方法
1 原理
ATAC-seq 是通过使用高通量测序技术对转座酶Tn5可接近性核染色质区域进行分析的一种新型表观遗传学研究技术。该技术通过转座酶对某种特定状态下开放的核染色质区域进行切割，获得在该状态下基因组中所有活跃转录的调控序列，再通过聚类分析，挖掘这些开放位点的潜在结合转录因子，结合基因表达水平数据，发现关键的调控转录因子。
这个技术用到了一个转座酶Tn5：DNA转座是一种由DNA转座酶介导，把DNA序列从染色体的一个区域插入到另外一个区域的现象，类似于“剪切粘贴”。这个过程，也是需要插入位点的染色质是开放的，否则就会被一大坨高级结构给卡住。

既然转座酶Tn5容易结合在开放染色质上，只要人为地将将NGS接头连接到转座酶，携带这些接头的转座酶（如下图带着红色蓝色测序标签的转座酶Tn5）进入细胞核后，在染色质开放区域各种切切切，使染色质断裂并将这些接头插入到开放的染色质区域中，这样我们裂解细胞、破碎DNA后，利用已知序列的测序标签进行NGS测序，就知道哪些区域是开放染色质了。

2 应用
染色质开放性图谱绘制
找调控生物学过程的关键转录因子
找哪个转录因子调控了研究的基因
找转录因子调控的靶基因
3 技术限制
Tn5通过插入剪断DNA 并将测序接头连接到剪断的两个DNA 片段的末端，因此对于一个DNA 片段而言，其两端的接头连接是随机的，这便导致同一片段两端的接头有50%的概率是同一接头。而只有连接不同接头的片段才可用于富集扩增及测序，因此，有一半的片段无法利用；
大量剪断的DNA 由于片段过大，无法进行PCR富集;
Tn5 的活性受反应溶液的组成及反应条件影响，仍然需要优化以便提高剪切效果；
ATAC-seq在植物细胞中存在以下难点：细胞壁的存在，叶绿体、线粒体等细胞器的污染，缺少稳定遗传的细胞系;

这篇讲的很清楚，而且浅显易懂~~嗯，是我喜欢的style。
分享给你们。
ATAC-seq：染色质开放性测序技术 - 知乎 (zhihucom)

盗它的几张图吧，自己你不懂的时候也可以随时翻出来看看。嘿嘿。

真核生物的核DNA并不是裸露的，而是有蛋白质即组蛋白与之相结合的。DNA一圈一圈地缠绕在组蛋白上，形成串珠式的结构。而这样的结构还能够进一步折叠、浓聚，并在其他架构蛋白的辅助下，形成染色体。

打开的染色质，就叫开放染色质（open chromatin）。而染色质一旦打开，就允许一些调控蛋白（比如转录因子和辅因子）跑过来与之相结合。而染色质的这种特性，就叫做染色质的可进入性（chromatin accessibility）。

DNA转座，是一种把DNA序列从染色体的一个区域搬运到另外一个区域的现象，由DNA转座酶来实现。这种转座插入DNA，也是需要插入位点的染色质是开放的，否则就会被一大坨高级结构给卡住。

那么，如上图a，我们只要人为地，将携带已知DNA序列标签的转座复合物（即带着红色蓝色测序标签的转座酶Tn5），加入到细胞核中，再利用已知序列的标签进行PCR后测序，就知道哪些区域是开放染色质了。而这也就是ATAC-seq的原理。

ATAC-seq出来的结果，和传统方法出来的结果具有很强的一致性，同时也和基于组蛋白修饰marker的ChIP-seq有较高的吻合程度。也就是说，ATAC-seq中的peak，往往是启动子、增强子序列，以及一些反式调控因子结合的位点。

相比起来，ATAC-seq的重复性，比MNase-seq和DNase-seq的更强， *** 作起来也更加简单，而且只需要很少的细胞/组织量，同时出来的信号更加漂亮。目前已经是研究染色质开放性首选的技术方法。

在准备NGS文库的时候，会有用到转座酶Tn5， Nextera DNA Library Preparation Kit ，比如ATAC-seq就有用到这个Tn5。转座酶携带有特定的序列称为 转座子Transposon 。

下面是ATAC-seq的工作原理，想必听说过ATAC-seq的，对这个图都会再熟悉不过了。

Tn5是kit里面带有的，没什么大不同。ATAC-seq 的barcoded primers （adaptors）会有一些不同，接下来，看下图中的每段序列对应的sequnce都是什么。

下面图例，Nextera tn5用来给基因组DNA加adaptors。

下面的就是准备ATAC-seq时候需要用到的index primer （adaptor），和Nextera DNA library prep kit里的有一点类似，但是也很不同。Ad1_noMX是Forward 引物，没有index （barcode），所以只有一个。Reversed引物有24个Ad2（1-24），所以有24组不同的index （barcode）序列。这个index序列是和Nextera一样的。我涂红色部分就是index序列的反向反义序列，每个index序列是不同的8个碱基，这个和Nextera的i7（部分一样，请自己对照）是一样的。

i5 sequence: ATAC-seq的Adaptor1 里没有barcode

i7 sequence:

有两种Adaptors，分别为Adaptor1 （50bp） 和Adaptor2 （53bp）。

其中Adaptor1（5’ illumina Primer1 sequence （29bp）+ Tn5 Read1 sequence（14bp）（再延伸到ME里面7bp）3’），Adaptor2（5’ illumina Primer2 sequence（24bp）+ barcode sequence （8bp）+ Tn5 Read2 sequence （15bp）（再延伸到ME里面6bp）3’）

这样算来，ATAC-seq library的长度=左面（Adaptor1 长度 +剩余部分Tn5的ME（12 bp_TATAAGAGACAG））+ open chromatin 的DNA长度+右面（剩余部分Tn5的ME（13bp_GTATAAGAGACAG）+ Adaptor2 长度）=open chromatin 的DNA长度 + 128bp。

所以，在ATAC-seq的libraries中 mono nucleosome的ATAC-seq library长度大概是(单核小体146bp+核小体free region)+两端的adaptor及Tn5最里面部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=274bp+free region，也就是bioanalyzer里面看到的第二个peak。图中显示大概是340bp左右。所以free region应该是330bp-274bp=56bp 。

那么会问，对不对呢？看下bioanalyzer的第一个peak，显示是182bp，这个peak代表的是nucleosome free region的ATAC-seq library，所以是nucleosome free region序列长度 + 两端的adaptor及Tn5部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=182， 所以，不难得出同样的结果，nucleosome free region序列长度是54bp。差不多哦

以此类推，第三个peak代表de-nucleosome ， 500bp到550 bp之间，是不是等于两个核小体长度加上核小体空隙序列再加上两个adaptor， 2 146bp + 2 55bp + 128bp= 530bp （为什么55bp也要乘2？答：多出来一个核小体当然就多出来一份核小体空隙）

nucleosome free region, mono-nucleosome, de-nucleosome and try-nucleosome

“GAP不是服装品牌，而是个坑”。

所以需要在PCR第一步，需要5min的72摄氏度来填坑。
还要注意，就是在tagmentation的时候会出现三种产物，上面的图只是其中一种。

哪里说的不对欢迎纠正，请留言。

参考：
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