单细胞测序平台的比较（2014-2020）

单细胞（single cell）分选平台比较（10X Genomics，BD Rhapsody，Fluidigm C1）

那么问题就来了：
从上图中我们可以看到，2010年-2014年之间，单细胞测序领域采用的主流技术的细胞通量都在100以内，哪怕是最为先进的Fluidigm C1平台也是如此。因此我们在2014-2016年间看到的大量Single-Cell Seq的高分文章的单个细胞测序数量一般都在1000以内，因为这1000个细胞代价极大。

Fluidigm C1平台，是最早被应用于Single Cell领域的商业化分选技术，基于富鲁达（Fluidigm®）的微流控技术，大约在几个小时中可以捕获96个左右的细胞，进行各类的Single-Cell测序建库。当然，通量还是比较小。但不可否认的是，现在很多非RNA类Single Cell测序，仍然在采用这样的技术，如Single Cell DNA-Seq，Single Cell ATAC-Seq等，都是采用此技术进行单细胞分选后再分别用不同试剂盒建库。所以可以说，至少在10X和BD，或者其他企业推出有效的Single DNA测序技术之前，C1仍然会是市场上的重要组成部分。

令人亢奋的是，在2014-2015年间几个性技术诞生了，仿佛寒武纪大爆发一般，MARS-Seq、CytoSeq、Drop-Seq、inDrop技术在这两年中扎堆出现，真正引爆了Single-Cell这个领域。而在2017-2018年，商业化的测序平台（10X Genomics®, BD Rhapsody®），逐渐浮出水面，才最终让Single-Cell测序技术走进了民用市场。
10X Genomics
BD Rhapsody

从成本上来说，基于C1类的捕获技术的代价非常大，单细胞捕获成本在9-30美元不等，而且这还是一个没有关税、没有代理商加价的价格。2000-3000细胞需要18000-100000美元不等的捕获费用，可以说非壕不可用的技术。因此暂时就不做详细讲解了。
Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods[J] Molecular cell, 2017, 65(4): 631-643 e4

主要讲讲两个现在的主流技术，BD Rhapsody以及10X Genomics。从诞生年代来看，两者不分伯仲，10X Genomics起源自Drop-Seq技术，得益于哈佛大学的研究所的工作。
从Drop-Seq技术到10X Genomics技术

BD的Rhapsody平台，最早可以追溯到2015年Single Cell Cytoseq技术，可以说是完全同时代的技术。2017年BD也携一篇研究脑神经的Nature Article将该商业化技术发布了。（Birey F, Andersen J, Makinson C D, et al Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids[J] Nature, 2017, 545(7652): 54）
10X Genomics和Drop-Seq具有类似的技术原理。从横向孔道中逐一输入凝胶微珠，第一纵向孔道输入细胞，凝胶微珠与细胞碰撞后会吸附在凝胶微珠上，并通过微流控技术，将之输入到第二纵向孔道，即油相孔道中。这时候，就形成了一个个油滴，最终输出并收集在EP管中。每一个油滴中会落入一个细胞以及一个凝胶微珠，那么在每一个凝胶微珠中上长满了不同的Cell Barcode和UMI Barcode连接形成的序列，再加上一端PolyT的抓手，构成我们的捕获凝胶微珠。而这个凝胶微珠抓手就会使用oligo dT抓住mRNA构建文库。
10X Genomics凝胶微珠设计

所以一个油滴=一个单细胞=一个凝胶微珠=一个RNA-Seq，可以说这就是10X的基本技术原理。

然而市场并不只有一家Single Cell的商业化捕获平台，另外还有BD这个老牌的抗体巨头的Rhapsody平台。这个平台又是依托什么技术，和10X Genomics技术存在什么区别呢？

BD的技术不再采用利用微流控孔道射出细胞和射出的磁珠碰撞的过程，进行单细胞捕获的技术，转而采用CytoSeq特有的蜂窝板技术。该技术用20W+的微孔（该数量级远大于Input细胞数量），保证单孔中的单细胞捕获。同时避免了10X中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题，采用微孔捕获相对会有更好的捕获效率（来自两家企业商业宣传资料比对），保证Input细胞的全面使用。对于Input细胞的量更少的情况，可以基于10E5的细胞总量开始进行前期处理以及后期捕获 *** 作。（烈小冰在之前的实验技术分享里提到过 Single Cell前处理会丢失一些细胞哦！） 而在细胞捕获完成后，进行细胞裂解后，同样的也进行细胞中RNA polyA序列的抓取工作。
BD Rhapsody 单细胞mRNA抓取过程

所以一个微孔=一个单细胞=一个磁珠=一个RNA-Seq，可以说这就是BD的基本技术原理。

从现有数据来看，我们很难比较两种技术的优劣，但是从现有的文章发表情况来看，两种技术都在主流高IF期刊上有可信的数据发表，并且都与Smart-Seq数据的结果存在比较，因此两种技术都是可用可信的大规模Single Cell RNA-Seq技术。从发布时间来看，10X发布更早，而BD发布在其1年之后，这点上10X Genomics的设备稍占优势。而在捕获效率和有效性来看，BD Rhapsody的捕获效率更高较占优势。

从技术原理上分析两种Single Cell测序技术，都是基于UMI（Unique Molecular Identifier）+ CL（Cell Label）的技术，与传统Smart-Seq + Fluidigm的C1技术比较起来，引入UMI技术（这个我们会在分析部分简单介绍）进行表达定量，使得大规模scRNA-Seq的基因表达定量结果几乎不会受到PCR Bias影响，从而更精确。
图注：如果一个基因具有序列一致的UMI序列的测序Reads，那么这条Reads其实PCR Bias
Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods[J] Molecular cell, 2017, 65(4): 631-643 e4

1、手机钉钉直播的，没有声音可能是没有打开录音权限，在设置中找到应用管理，点击钉钉，在权限中将录音、麦克风的权限都打开，手机音量和媒体音量都调高，看有没有声音。
2、首先鼠标右键点击电脑任务栏的喇叭图标，点击打开声音设置，查看输出设备和输入设备是否正常连接，把麦克风和扬声器的声音都调大，这样就有声音了。
3、如果电脑的声音正常，说明是钉钉的设置问题，在直播的界面上点击上方的声音设置图标，进入后可以看到麦克风和扬声器的开关，将开关都打开，再调大音量，说话时下方有绿色点状标志就代表有声音输入。

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