简述检测蛋白质磷酸化的检测方法及其原理

方法及原理：

1.激酶活性分析

生物学样品中的激酶活性通常是在体外测定的，在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育。之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化，包括显色、放射性或荧光检测。

直接测定蛋白磷酸化的一种经典方法是将整个细胞与放射性标记的32P-磷酸盐共同孵育，获得细胞提取物，通过SDS-PAGE分离，并曝光在胶片上。这种繁琐的方法需要多次几小时的孵育，且使用放射性同位素。其他传统方法包括2D凝胶电泳，这种技术假定磷酸化会改变蛋白的迁移率和等电点。

2.WesternBlot

利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上（通常是PVDF或尼龙膜），之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。

由于测得的磷酸化蛋白水平可能随处理或凝胶上样误差而变化，研究人员常常利用一个抗体来检测同源蛋白的总水平（而不考虑磷酸化状态），以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并充当上样内对照。化学发光和显色法都很常用，而分子量marker常用来提供蛋白分子量的信息。

3.酶联免疫吸附分析（ELISA）

ELISA的定量能力优于Westernblot，且在调节激酶活性和功能的研究中表现出巨大的作用。这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品（如细胞裂解液）中的一个组分。加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。这些分析通常设计为显色或荧光检测。

4.基于细胞的ELISA

来自目的蛋白的信号可通过第二种蛋白来标准化，校正各孔之间的差异，实现磷酸化蛋白水平的准确评估，并比较多个样品，与传统免疫印迹中使用磷酸化特异和总蛋白抗体相似。这些分析绕过了制备细胞裂解液的需要，因此更适合高通量分析。

5.质谱

首先，磷酸化肽段的信号通常较弱，因为它们带负电荷，而电喷雾质谱在正电模式下作用，因此电离效果不好。其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很难观察到低丰度目的蛋白的信号。

6.多个分析物图谱分析

磷酸化是将磷酰基 (PO 3 - ) 化学加成到有机分子上。磷酸基团的去除称为去磷酸化。磷酸化和去磷酸化均由酶（例如激酶、磷酸转移酶）进行。磷酸化在生物化学和分子生物学领域很重要，因为它是蛋白质和酶功能、糖代谢以及能量储存和释放的关键反应。

磷酸化的目的

磷酸化在细胞 中起着关键的调节作用。其功能包括：

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如何让小组工作顺利进行

对糖酵解很重要

用于蛋白质-蛋白质相互作用

用于蛋白质降解

调节酶抑制

通过调节需要能量的化学反应来维持体内平衡

磷酸化的类型

许多类型的分子可以进行磷酸化和去磷酸化。三种最重要的磷酸化类型是葡萄糖磷酸化、蛋白质磷酸化和氧化磷酸化。

葡萄糖磷酸化

葡萄糖和其他糖类通常被磷酸化作为其分解代谢的第一步。例如，D-葡萄糖糖酵解的第一步是将其转化为 D-葡萄糖 6-磷酸。葡萄糖是一种容易渗透细胞的小分子。磷酸化形成一个较大的分子，不容易进入组织。因此，磷酸化对于调节血糖浓度至关重要。反过来，葡萄糖浓度与糖原形成直接相关。葡萄糖磷酸化也与心脏生长有关。

蛋白质磷酸化

洛克菲勒医学研究所的 Phoebus Levene 是 1906 年第一个发现磷酸化蛋白质（磷蛋白）的人，但直到 1930 年代才描述蛋白质的酶促磷酸化。

将磷酸基团添加到氨基酸 时会发生蛋白质磷酸化。通常，氨基酸是丝氨酸，尽管磷酸化也发生在真核生物中的苏氨酸和酪氨酸以及原核生物中的组氨酸上。这是一种酯化反应，其中磷酸基团与丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸侧链的羟基 (-OH) 基团发生反应。酶蛋白激酶将磷酸基团共价结合到氨基酸上。原核生物和真核生物之间的确切机制有些不同。研究得最好的磷酸化形式是翻译后修饰 (PTM)，这意味着蛋白质在从 RNA 模板翻译后被磷酸化。逆反应，去磷酸化，由蛋白磷酸酶催化。

蛋白质磷酸化的一个重要例子是组蛋白的磷酸化。在真核生物中，DNA 与组蛋白结合形成染色质。组蛋白磷酸化修饰染色质的结构并改变其蛋白质-蛋白质和 DNA-蛋白质相互作用。通常，当 DNA 受损时会发生磷酸化，从而在断裂的 DNA 周围打开空间，以便修复机制发挥作用。

除了在DNA 修复中的重要性外，蛋白质磷酸化在代谢和信号通路中也起着关键作用。

氧化磷酸化

氧化磷酸化是细胞储存和释放化学能的方式。在真核细胞中，反应发生在线粒体内。氧化磷酸化由电子传递链反应和化学渗透反应组成。总之，氧化还原反应将来自蛋白质和其他分子的电子沿着线粒体内膜的电子传递链传递，释放用于在化学渗透中制造三磷酸腺苷(ATP) 的能量。

在这个过程中，NADH 和 FADH 2将电子传递到电子传输链。电子沿着链前进时从较高能量移动到较低能量，沿途释放能量。该能量的一部分用于泵送氢离子 (H + ) 以形成电化学梯度。在链的末端，电子被转移到氧上，氧与 H +键合形成水。H +离子为 ATP 合酶提供能量以合成 ATP。当 ATP 被去磷酸化时，裂解磷酸基团会以细胞可以使用的形式释放能量。

腺苷不是唯一经过磷酸化形成 AMP、ADP 和 ATP 的碱基。例如，鸟苷还可以形成 GMP、GDP 和 GTP。

检测磷酸化

可以使用抗体、电泳或质谱法 检测分子是否被磷酸化。然而，识别和表征磷酸化位点是困难的。同位素标记通常与荧光、电泳和免疫测定结合使用。

来源

克雷斯格，妮可；西蒙尼，罗伯特 D.；希尔，罗伯特 L. (2011-01-21)。“可逆磷酸化过程：Edmond H. Fischer 的工作”。生物化学杂志。286（3）。

夏尔马，索米亚；格思里，帕特里克 H。陈苏珊娜S.；哈克，赛义德；Taegtmeyer, Heinrich (2007-10-01)。“心脏中胰岛素依赖性 mTOR 信号传导需要葡萄糖磷酸化”。心血管研究。76（1）：71-80。

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