引物设计时如何添加酶切位点

因此，需要在5端加上酶切位点记得再加上一些保护碱基，因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来保护碱基的具体数目一般5-6个。引物的结构就应该是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列

重组时选择你的目的基因上没有，而质粒的多克隆位点上有的酶切位点，一般重组质粒需要两个酶，所以你要选择两个酶切位点，注意尽量避免使用切出平末端的酶。重组引物设计时首先你要确定你选择的两个酶在的酶切位点在质粒的多克隆位点上的排列顺序，这个不能错，不然序列就会接反。一般设计重组引物的时候，在上游引物5’端前面加上载体多克隆位点排列在前面的酶切位点序列，在下游引物5‘端前面则加上后面的一个酶切位点，酶切位点加好后，注意5’端还需要加上保护碱基，这个具体你可以去查下内切酶的说明书。然后你要注意，根据你的载体需要，是否要在引物上带上启动子和终止子。

你可以设计带有酶切位点的引物，对目的基因进行PCR，就可在目的基因上引入酶切位点。

步骤：引物设计（借助软件）——合成引物（公司合成）——PCR。

最重要的一个仪器就是PCR仪了，具体的加什么试剂，加多少，我想楼主应该是做分子生物学，这些应该挺清楚的了。

楼主，引物一般是用软件设计，例如Primer.5，你根据你的目的基因两端的特点，设计合适的引物，然后在引物上再添加酶切位点

，例如EcoRⅠ

是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：

5'

G↓AATTC

3'

3'

CTTAA↑G

5'

，你就可以在这两条引物上分别添加这几个脱氧核苷酸，这不就在引物中引入酶切位点了吗？经过PCR后引物和目的基因连在一起，酶切位点自然也连上去了。楼主，你可以根据需要，引入不同的限制性内切酶的酶切位点。

---