SnapGene简单入手(四)

“ SnapGene是构建质粒的利器。 ”

        上次介绍了双酶切克隆和TA克隆，这次介绍一种和TA克隆比较相似的TOPO克隆，唯一的区别就是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上，而TOPO克隆是基于拓扑异构酶(Toposiomerase)的克隆，是一种不利用限制酶和连接酶的DNA克隆方法，该技术依赖于A和T碱基的互补配对，因此也可以称为TOPO-TA，用于黏性末端；当然也可用于平末端的连接。

        这一部分以PDCD-1(程序性死亡受体1)为目的片段，使用TOPO克隆方式进行构建目的载体。

1. TOPO克隆作用机制

拓扑异构酶(Toposiomerase)是存在于细胞核内的一类酶，他们能够催化DNA链的断裂和结合，从而控制DNA的拓扑结构，拓扑异构酶参与了超螺旋结构模版的调节。

 PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。TOPO克隆使用了牛痘病毒中分离出的拓扑异构酶I，识别DNA序列5'-(C/T)CCTT-3'并在此序列上酶切双链DNA，暴露出T位点同时DNA断裂释放的能量储存在其 3'胸腺嘧啶脱氧核苷的磷酸基团和拓扑异构酶I上的酪氨酸残基之间的共价键中。它在识别位点切割DNA一条链，然后使其解链，之后TA配之后酶会重新连接被切割的位点，并将自身从DNA上释放出来。下图为黏性末端和平末端基础机制。

Taq 扩增的DNA的TOPO TA Cloning

利用Zero Blunt TOPO克隆方法克隆平末端DNA。

利用定向TOPO克隆方法克隆平末端DNA。

图片来自于赛默飞官网

2. TOPO工作流程

    基本上和TA克隆是相似的，感兴趣的可以看看前面的。这里简略介绍一下，就是目的片段扩增好之后与TOPO质粒载体共孵育5min即可进行下一步的感受态细胞转化。

3. 目的片段的获取

在NCBI上按照上次的方法找到PDCD-1的CDS片段，然后导入到snapgene中，做好自己想要的特征标记。

4. TOPO克隆

1. 将目的片段选择好之后，选择作为PCR模板，用来设计后续的引物；也可以按自己需求直接作为模板。

        2. 选择合适满足自己需求TOPO-TA克隆的质粒载体。

3. 选择引物，snapgene会按照Tm设计好扩增引物

        4. 点击克隆，名字取好，就可将目的质粒保存好，进行后续的研究。

同理，TOPO平端克隆也是同样的 *** 作。

同理，TOPO定向克隆也是同样的 *** 作。

5. 模拟电泳

模拟电泳是snapgene中非常有趣和实用的一个功能，在这里补充介绍一下。

上图是电泳界面，简单一一介绍一下。

1. 电泳图谱

和实际电泳图跑出来非常相似，可以用来提前预测结果，然后进行结果对照，查看问题点在哪里，下方是泳道信息调整和相对应的工具栏。

2. 泳道调整和酶切位点的选择

进行每一个泳道的调整和选择相应的酶切位点进行电泳。

3. 质粒图谱

质粒图谱和相对应的工具栏，和之前的界面是一样的，都可以进行 *** 作。

    泳道1 是线性PCDC1的电泳图

泳道2 是质粒的超螺旋电泳图，能够明显看到质粒是6708bp分子量，但是超螺旋的质粒明显在6kb marker下面，这主要是因为DNA在超螺旋后，改变了自身的拓扑结构，消除了部分溶液中与其作用的氢键，使DNA磷酸骨架中更多的负电荷直接暴露在了电场之中，在电泳的作用下，其可更快速的移动至正极，使得电泳结果看起来分子量要偏小一些。

泳道3 是使用一个酶切线性化后的电泳图，分子量就符合预期。

泳道4 是使用两个酶酶切后的电泳图

泳道5 是使用引物扩增之后得到产物的电泳图，可用来鉴定。

    最后一个TOPO克隆设计就完成了，另外还介绍了模拟电泳的使用。这只是前面最基础的设计部分，依靠软件即可完成，后续的鉴定，转化，验证，表达，纯化等等都需要大量的学习才能顺利完成，希望这部分内容能对大家有所帮助。

    按照实验需求，质粒构建分为克隆质粒，表达质粒，基因敲除质粒，报告质粒，病毒质粒，基因组工程质粒等。

    这部分以pEGF-N1为backbone，human p53 coding sequence 为插入序列，用传统的双酶(EcoR I和BamH I)切重组质粒的方法，介绍质粒元件和snapgene的基本 *** 作流程。

1. Snapgene 打开pEGF-N1

    SnapGene打开新文件的方式有两种，一种是找到质粒的全部序列，复制粘贴或者直接将质粒序列TXT文档拖拽到snapgene，snapgene会自动识别，即可打开质粒图谱；另外一种是输入，NCBI序列，addgene序列，snapgene在线序列，输入想要查找的质粒名称/编号，即可在线加载出来质粒。全面的是打开snapgened出的界面，后面的是通过工具栏打开新文件。

    收藏的工具是将多个质粒全部放在一个收藏夹中，相当于照片放在相册里，打开一个收藏夹就是你自己保存的质粒组，方便进行质粒的管理，但是这个功能sanpgene viewer没有。

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2. pEGF-N1

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        大部分元件如复制起点，抗性基因，蛋白标签等在前面已经介绍过了，还有模糊的可以翻回去看看，这里补充一下终止子。

        终止子：顾名思义就是终止mRNA转录的因子，界定了一个转录单元的结束，位于基因下游，通常紧跟着polyA(聚腺苷酸：多个腺苷酸(A)，在真核中ployA能延长转录本的寿命，保持稳定；原核生物中加快转录本的讲解)。

        原核的转录子分为两类：一类是依赖 ρ因子(Rho)，一类是不依赖的。ρ因子是一种解旋酶，能够辅助RNA聚合酶转录终止，此系统在质粒中比较少见；在细胞表达质粒中常见的是非ρ因子依赖的终止子。非依赖性ρ因子是一种固有强终止子，即富含GC的回文结构，富含氢键。下图为非典型ρ因子终止子示意图。几乎所有常用细胞表达质粒都是非ρ因子终止子，包括T7，rrnB等。

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    真核的转录在启动子的时候讲过按照核酶分为三类，核酶I，II，和III。每种核酶终止方式不同，核酶I用来转录rRNA，依赖ρ因子类似原核；核酶II转录mRNA和miRNA，依赖ρ因子和RNA酶相关蛋白参与招募剪切和加polyA；聚合酶III转录tRNA和smRNA，依赖特定RNA二级结构和特定序列。

    哺乳动物细胞表达质粒常用于转录mRNA，常用终止子有SV40，hGH，BGH和rbGlob等，polyA信号序列同终止序列是同意的。

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    如上图所示，在polyA与富含GU之间协同进行切割，释放mRNA和核酶，polyA尾在mRNA核外转运和翻译过程中起维持mRNA稳定、避免其被降解的重要作用。但是在病毒载体中，polyA与包装系统连用，会降低病毒滴度，延长转录本的寿命，所以使用较弱的终止信号。

3. Human p53 设计引物

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    在NCBI中搜索human p53，找到相对应的mRNA序列，搜索找到CDS区域，如图中深色部分，然后复制粘贴到snapgene中，用来构建引物。

    将human p53的CDS 按照前面添加DNA文件的方法，在snapgene中打开，选择BamHI酶和EcoRI酶进行酶切，引物设计需要添加酶切位点和保护碱基。

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    按照自己需要，命名完整准确，酶切问点可以在snapgene中选择添加，保护碱基可以百度查看。

    使用snapgene模拟功能，能够看到PCR反应产物，有两个酶切位点存在，将扩增产物保存好。

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4. 克隆

    在snapgene中有模拟克隆的功能，能够将双酶切克隆的结果可视化，让自己做到心中有数。行动--限制和插入片段克隆--插入片段。

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    选择好各自的酶切位点，即可看到自己设计的质粒。这部分主要以双酶切重组质粒为基础，快速熟悉snapgene的简单引物设计，PCR反应，插入片段克隆以及补充的终止子等，希望能有所帮助。

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