设计引物时同源臂怎么加

用PCR扩的时候就把同源重组片段引入，vector酶切后 5'端选15nt，3'端选15nt分别加到正向引物和反向引物上，就做成了同源臂。 

同源序列是指在同一物种不同个体间或不同物种间相同或相似的DNA序列，而同源臂是指一段同源序列，类似于tRNA氨基酸臂的结构，所谓臂，指的是手臂样结构。

弓|物是人工合成的两个寡核苷酸序列:一个引物与靶区域-端的一条DNA模板链互补,另一个弓|物与靶区域另一端的另-条DNA模板链互补,其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点,核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。

好的引物会让PCR实验成功一半，因而，引物设计一直都是PCR非常重要的环节。PrimerPremier5和Oligo7这两款软件想必是备受科研汪们推崇的引物设计软件。

引物设计简介：

引物设计是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。

1、首先，退火温度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8）只是粗算，有时不灵，但比较简便。

2、其次，用primer5（oroligo6）计算，引物配对好后，primer5可以显示Tm，认为这个值就是退火温度，再加2or3度最好。

3、最后，合成引物的单子上也有个Tm，减去5～8也可，但有些公司提供的Tm就是方法1计算的。

无缝克隆，让载体构建变得像搭积木一样简单

吴思涵

知识星球「生物狗窝」，生物医学同行交流社区

前言

提起“克隆”、“载体构建”这两个词，似乎总会同时提到“限制性内切酶”。没错，在过去数十年，用限制性内切酶产生黏性末端，并通过碱基互补配对，连接两个甚至更多片段的克隆方法，是载体构建的经典方案。

近年来，“无缝克隆”逐渐受到科学家的欢迎。相比之下，无缝克隆 *** 作更加简单，灵活性更强，同时几乎不受序列的限制，一次可定向组装高达10个片段的dsDNA。这篇文章将带大家认识无缝克隆的原理、优势和应用。

一、无缝克隆的原理

首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：Gibson assembly和Golden Gate assembly。由于Golden Gate assembly依赖于Type IIS限制性DNA内切酶（如BsaI，BbsI等），一旦载体不携带相应的识别序列，这种方法就走不通了。而假设通过PCR引入Type IIS内切酶识别序列，那便不是真正意义上的“无缝”了。因此本文所提的“无缝克隆”，特指Gibson assembly流，不涉及任何Golden Gate及其他流派。

目前，无缝克隆比较著名的商品化名字有NEB家的Gibson Assembly和NEBuilder HiFi DNA Assembly，Clontech家的In-Fusion，以及Invitrogen家的GeneArt等。但无论叫什么名字，其基本原理都和早期的Gibson assembly的是一样的。

与传统的双酶切克隆一般，无缝克隆同样需要依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对，并利用DNA连接酶催化形成磷酸二酯键修复缺口（nick）。但是，无缝克隆并不使用“内切酶”来制造黏性末端，而是通过“外切酶”来产生的。

（Tips 1：“内切酶”是在核酸链内部进行“一刀两断”剪切的酶，而“外切酶”是在核酸链的末端、即外部进行“逐个碱基”剪切的酶）

在无缝克隆中使用的外切酶是T5核酸外切酶，它能沿着5’→3’方向，降解dsDNA，从而产生黏性末端。

（Tips 2：T5外切酶同时具有ssDNA外切酶活性，但并不降解超螺旋dsDNA。）

读到这里大家应该能想到，假设要拼接的两个片段的末端，是一模一样的碱基序列，那么通过T5外切酶，就能产生几乎一致的黏性末端了。没错，无缝克隆的原理便是如此。如下图所示，假如我们需要将3个片段按照1→2→3的顺序拼接起来，只需要保证1的末尾和2的开头，以及2的末尾和3的开头，具有同样的序列即可（我们可称之为同源臂）。这个同源臂序列，并不是额外添加进去的，而是载体或者拼接片段本身携带的。也就是说，我们可以通过PCR的方法，在外源拼接片段的两端加上线性化载体

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