免疫检测方法

免疫检测方法大全2017

免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于有关免疫疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。如对传染病、免疫增殖性疾病、免疫缺损病、超敏反应、自身免疫病、移植排斥反应肿瘤的免疫学检测，对诊断、治疗均有很大帮助。此外在医学生物学研究中对抗原性物质或细胞的定性、定量检查不仅推动了对各种免疫学现象的研究，而且扩大免疫学与医学生物许多领域的联系。本章仅介绍常用免疫学检测方法的原理，简要过程和实用意义。下面是我为大家带来的关于免疫学检测法的知识，欢迎阅读。

第一节　抗原或抗体的检测

一、检测的原理

借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。

1抗原与抗体的亲和力(affinity)抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样不是化学的反应，而是非共价键的可逆的结合。抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度不同，抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。互补程度高，则亲和力强。此外，反应温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重要的影响，抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。高亲合力的抗体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。

2抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。定性和定位检测比较简单，即用已知的抗体和待检样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原存在。同理也可用已知的抗原检测样品中是否有相应抗体。

对抗原或抗体进行定量检测时，以反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。

(1)根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原(或抗体)的含量：在一定的反应条件下，加入的已知抗体(或抗原)的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原(或抗体)量成正比。也就是抗体浓度一定时，免疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原(或抗体)的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。

(2)抗原或抗体效价滴定的原理：当抗原抗体复合物形成多少不能反应抗原抗体反应强弱时，就不能以检测反应强度来对抗原或抗体进行定量。在实际工作中，把浓度低的反应成分(抗原或抗体)的浓度固定，把浓度高的另一种反应成分作一系列稀释。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比较3只家兔产生抗体的多少，即滴定3只兔血清抗体效价，可用双向琼脂扩散法来滴定，例如将抗体浓度固定，将抗原作不同的稀释度，分别将抗原或抗体滴入琼脂的相应小孔中，观察免疫兔血清与不同稀释度的抗原出现明显沉淀浅的抗原稀释度(如甲兔的抗体效价为1/2000，而丙免的是1/8000则可比较出后者比前者产生抗体的效价要高)。也就是表示效价的稀释度越高，样品中所含待检成分越多。因人血清(抗原)和抗体(免疫兔血清)相比，浓度高，故应稀释抗原。

二、抗原或抗体检测的实用意义

1抗体检测的意义检测抗体可用于评价人和动物免疫功能的指标。抗体用于临床治疗或实验研究时也需做纯度分析和定量测定。临床上检测病人的抗病原生物的抗体、抗过敏原的抗体、抗HLA抗原的抗体、血型抗体及各种自身抗体，对有关疾病的诊断有重要意义。

2抗原检测的意义可做为抗原进行检测的物质可分为以下四类：

(1)各种微生物及其大分子产物：用于传染病诊断、微生物的分类及鉴定以及对菌苗、疫苗的研究。

(2)生物体内各种大分子物质：包括各种血清蛋白(如各类免疫球蛋白、补体的各种成分)、可溶性血型物质、多肽类激素、细胞因子及癌胚抗原等均可做为抗原进行检测。在对这些成分的生物学作用的研究以及各种疾病的诊断有重要意义。

(3)人和动物细胞的表面分子：包括细胞表面各种分化抗原(如CD抗原)、同种异型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相关抗原和肿瘤相关性情抗原等。检测这些抗原对各种细胞的分类、分化过程及功能研究、对各种与免疫有关的疾病的诊断及发病机制的研究，均有重要意义。

(4)各种半抗原物质：某些药物、激素和炎症介质等属于小分子的半抗原，可以分别将它们偶联到大分子的载体上，组成人工结合的完全抗原。用其免疫动物，制备出各种半抗原的抗体，应用于各种半抗原物质的检测，例如对某些病人在服用药物后进行血中药物浓度的监测。对运动员进行服用违禁药品的检测，都是应用半抗原检测的方法。

三、抗原或抗体检测的方法

由于各种检测方法中所用的抗原性状不同，出现结果的现象也不同。最广泛应用方法有下述几种：

(一)沉淀反应

可溶性抗原与抗体结合，在两者比例合适时，可形成较大的不溶性免疫复合物。在反应体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反应称为沉淀反应(precipitation neaction)。

1环状沉淀试验先将含抗体的未稀释的免疫血清加到直径小于05cm的小试管底部。将稀释的含有可溶性抗原的材料重叠于上，让抗原与抗体在两液体的界面相遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀试验(ring precipitationtest),此法简便易行，需用材料较多是其缺点。

2单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验(single immunodiffusion)是在凝胶中进行的沉淀反应。将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗体的琼脂板，在适当位置打孔，将抗原材料加入琼脂板的小孔内，让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。当复合物体积增加到一定程度时停止扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正相关。本方法简便，易于观察结果，可测定抗原的灵敏度(最低浓度)约为10～20μg/ml，常用于定量测定人或动物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺点是需1～2天才能看结果

3免疫比浊法　 当抗体浓度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不见的小免疫复合物，它可使通过液体的光束发生散射，随着加入抗原增多，形成的免疫复合物也增多，光散射现象也相应加强。免疫比浊法(immunonephelomytry)就是在一定的抗体浓度下，加入一定体积的样品，经过一段时间，用光散射浊度计(nephelometry)测量反应液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。本法敏感、快速简便，可取代单向扩散法定量测定免疫球蛋白的浓度。

4，双向免疫扩散试验　 双免疫扩散试验(double immunodiffusion)是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现2～3条沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。

5对流免疫电泳　对流电泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需1小时左右即可观察结果。

6免疫电泳　 免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法分成两个步骤，即先进行电泳，再进行琼脂扩散。先将样品加入琼脂中电泳，将抗原各成分依电泳速度不同而分散开。然后在适当的位置上沿电泳方向挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原混合抗体液，让各抗原成分与相应抗体进行双向免疫扩散，可形成多答卷沉淀线。常用此法进行血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义

7免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting)又称为Western印迹法，用于AIDS的血清抗体检测。第一步，为电泳分离HIV抗原，在电场中根据分子量大小不同病毒抗原各成分散开。第二步，将电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上(电印迹)，然后将印迹有病毒抗原的硝酸纤维膜浸湿于病人血清中。如果病人血清中含有与一种或几种抗原相对应的抗体的话，则在该抗原印迹部位形成免疫复合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和抗体后，在膜上加标记的抗人免疫球蛋白的抗体，此抗体可以和病毒抗原与人抗体形成的免疫复合物发生反应，最后加入显色底物(如果抗人Ig是用酶标记的)或做放射自显影(抗人Ig用125Ⅰ标记)以显示结果

第一步：经电泳将HIV混合抗合抗原按分子量大小分离;

第二步：将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上;

第三步：将待检病人血清加入覆盖于硝酸纤维膜上;

第四步：加入标记的第二抗体使之覆盖膜上;

第五步：加入显色底物(或放射自显影)显现第二抗体

(二)凝集反应

细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等都是不溶性的颗粒抗原，当与相应抗体结合，抗原与抗体结合形成凝集团块，即称为凝集反应(agglutination)。

1直接凝集直接凝集(direct agglutination)是将细菌或红细胞与相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。可用于传染病诊断如肥达氏反应(Widal reaction)诊断伤寒病。或利用血细胞凝集现象检查血型。

2间接凝集间接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应抗体混合出现的凝集现象。如用γ球蛋白包乳胶颗粒检测类风湿关节炎病人血清中的类风湿因子，用甲状腺球蛋白包被乳胶颗粒用于检测甲状腺球蛋的抗体。也可以将抗体吸附到乳胶颗粒上检查临床标本中的抗原，如细菌或真菌性脑膜炎抗体包被的乳颗粒，一旦与含有相应抗原的脑脊液混合，便可发生凝集，可进行快速诊断。故凝集反应即可测定抗原，也可测抗体，方法简便、敏感。

3抗球蛋白试验 抗球蛋白试验(antiglobulin test,coombs test)的原理为间接凝集试验。例如应用于诊断自身免疫溶血性贫血症时，Rh+红细胞与抗Rh血清间的反应。因抗Rh抗体是IgG只有两个结合价，分子较小(不如IgM结合价多，分子大)很难直接引起Rh+红细胞凝集。如果加入抗IgG的抗体，就可帮助抗Rh的IgG的抗体凝集红细胞。也就是经抗Ig的作用提高凝集反应的'灵敏度。

(三)补体参与抗原抗体反应

这一类反应主要包括溶血反应(hemolytic assay)、补体介导的细胞毒试验(complement mediated cytotoxicuty test)及补体结合试验(complement fixation test)。

1溶血反应抗体与红细胞表面抗原相遇，形成红细胞-抗体复合物即可使加入反应中的补体活化，导致红细胞溶解，此方法可用于红细胞的各种抗原或相应抗体的检测，此法比凝集反应敏感。溶血反应也是用于抗体分泌细胞即空斑形成细胞(PFC)检测的原理。

2补体介导的细胞毒试验各种有核细胞与针对其表面抗原的抗体相遇，所形成的免疫复合物能活化反应中的补体，引起细胞膜穿孔，在一定时间内，细胞仍能维持一定的形态不破碎，加入水溶性染如伊红Y(eosin Y)或台盼蓝(trypan blue)后，染料即可进入被活化补体穿孔的细胞，不带相应抗原细胞膜保持完整的活细胞不着色。此方法可用于带各种抗原的细胞的检测，如进行细胞MHC抗原的鉴定，和进行淋巴细胞中T细胞总数或其亚类的计数。在一些免疫学实验中也可用这种方法，根据需要特异地消除带某种抗原的细胞。

3补体结合试验当抗原(可溶性或颗粒性)与相应抗体结合，由于浓度低不出现可见反应时，应用补体结合试验可检出此抗原抗体反应，它比凝集反应或沉淀反应灵敏度高。本法包括两个抗原抗体系统。一为检测系统由待检样品与已知抗原(或抗体)组成;另一为指示系统，由绵羊红细胞(SRBC)和抗SRBC组成。另加入作为补体的新鲜豚鼠血清。试验时试管中先加入检测系统和补体，混合经37℃30分钟使抗原、抗体、补体形成复合物，再加入指示系统，如出现溶血现象，说明检测系统中没有相对应的抗原抗体，补体是游离的指示系统的SRBC和抗体结合而出现溶血，即为反应阴性。如不出现溶血，表明检测系统中有抗原抗体复合物并结合补体，则指示系统无多余的补体作用而没有溶血现象，即为阳性。

在敏感的抗原、抗体检测方法(如酶标方法)出现之前补体结合试验曾广泛用于检测各种细菌、病毒或螺旋体(如梅毒)的抗原或抗体，由于本试验影响因素多，结果不稳定现已被新检测方法所代替。

四、用标记抗体或抗原进行的抗原、抗体反应

用荧光素、同位素或酶标记抗体或抗原，用于抗原或抗体检测是目前广泛应用的敏感、可靠的方法。上述三种常用的标记物与抗原或抗体化学连接之后不改变后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位检测。

1免疫荧光技术　免疫荧光技术(immunofluorescence techni)是用化学方法使荧光素标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的相应抗原(或抗体)结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。

(1)直接荧光法：把荧光抗体加到待检的细胞悬液，细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体，将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在，此法可用于病毒感染细胞、带某种特异抗原的细胞(如T细胞和B细胞)或病原菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。本法的缺点是检查多种抗原，就需分别制备相应的多种标记抗体。

(2)间接荧光法：可克服直接法需制备多种荧光抗体的复杂 *** 作。将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体(不标记荧光)结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，观察结果与直接法相同。间接法比直接法敏感性高，如果用于检查抗原的第一抗体是人或动物的只需制备一种抗人或动物的免疫球蛋白荧光抗体

免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查抗原或抗体，如查出IgM抗体，可做为近期接触抗原的标志，所以使用荧光标记抗IgM可诊断近期感染。除微生物学方面的应用外，还可利用单克隆抗体鉴定淋巴细胞的亚类。使用流式细胞仪(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自动检测细胞的大小、荧光强度。针对细胞表面不同抗原，可以使用两种不同的荧光染料，如用异硫氰荧光素(FITC)发黄绿荧光，用罗丹明(TMRITC)发红色荧光。由于荧光颜色不同标记两种不同的抗体，对同一细胞进行双标记染色。对淋巴细胞亚类鉴定起着巨大推动作用。应用间接荧光法也用于自身免疫病的抗核抗体检查。

2放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)应用竞争性结合的原理，应作放射性同素标记抗原(或抗体)与相应抗体(或抗原)结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果，本方法可进行超微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种：

(1)液相法：将待检标本(例如含胰岛素抗原)与定时的同位素标记的胰岛素(抗原)和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，分离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计算结合率。在反应系统中，待检标本的胰岛素抗原与同位素标记的胰岛素竞争夺战　性与胰岛素抗体结合。非标记的抗原越多，标记抗原与抗体形成的复合物越少。非标记抗原含量与标记抗原抗体复合物的量呈一定的函数关系。预先用标准的非标记抗原作成标准曲线后，即可查出待检标本中胰岛素的含量

(2)固相法：将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体。测定固相载体的放射活性，常用的固相载体有溴化氰(CNBr)海豹化的纸片或聚苯乙烯小管

放射免疫分析法应用范围广泛，包括多种激素(胰岛素、生长激素、甲状腺素等)维生素、药物、IgE等。

3酶联免疫分析法 酶联免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是当前应用最广泛的免疫检测方法。本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酶(alkaline phosphatase)等。它们与抗体结合不影响抗体活性。这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原;后者主要测定可溶性抗原或抗体。本法既没有放射性污染又不需昂贵的测试仪器，所以较放射免疫分析法更易推广。

(1)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是与上述固相RIA相似的原理，将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行政区。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。

(2)夹心法(sandwich assay):将已知的特异抗体包装在固相载体(塑料板凹孔或纸片上)，加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。

间接法(indirecr ELISA)常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本(可能含有相应抗体)，再加入酶标抗Ig的抗全(即第二抗体)，经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。

(3)BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素(avidin)分子可以结合4个生物素分子(biotin)。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA)，它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。

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物联网技术应用在运输检测中，让运输货车以及货物可以实时得到监控、定位跟踪、检测货物的温度状态等情况。运输检测可以让货物的运输更加有安全保障，减少货物被损坏。让运输的过程可以更加安全，提高货物运输的效率，降低运输的成本，减少货物损耗的机率。

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免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫测定。
1． 体液免疫测定主要利用抗原与相应抗体在体外发生特异性结合，并在一些辅助因子参与下出现反应，从而用已知抗原或抗体来测知未知抗体或抗原。此外，尚包括检测体液中的各种可溶性免疫分子，如补体、免疫球蛋白、循环复合物、溶菌酶等。
2． 细胞免疫测定法是根据各种免疫细胞（T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨噬细胞等）表面所具有的独特标志和产生的细胞因子等，测定各种免疫细胞及其亚群的数量和功能，以帮助了解机体的细胞免疫水平。
体液免疫检测法
1凝集反应。
颗粒性抗原（细菌或红细胞等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下形成肉眼可见的凝集物，称之为凝集反应。
1）直接凝集反应。颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的凝集现象，前者多为细胞表面的结构成分，如细菌或红细胞的表面结构抗原。⑴玻片法：多用于抗原的定性检测。⑵试管法：多用于抗体的定量检测。
2）间接凝集反应。将可溶性抗原吸附于载体颗粒（如乳胶颗粒、红细胞等）的表面，称之为致敏颗粒。当致敏颗粒与相应抗体结合，即可出现凝集现象。这个反应常用于测定细菌性抗体、病毒性抗体、钩端螺旋体和梅毒螺旋体抗体及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等）。
根据凝集反应的原理，还有间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验、协同凝集试验等。
2．沉淀反应。
可溶性抗原（外毒素、血清、细菌培养的滤液、组织浸出液等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下，形成沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原多为多糖、类脂、蛋白质等。
1）单向扩散试验。这是一种抗原定量试验，是可溶性抗原在含抗体的琼脂介质中扩散的沉淀反应。此法常用于检测血清免疫球蛋白和补体各成分的含量。
2）双向扩散试验。这是可溶性抗原与抗体在琼脂介质中相互扩散的沉淀反应。本法常用于定性试验，如检测血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。单克隆抗体技术
3）对流免疫电泳。对流电泳是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。此法常用于检测血清中的乙型肝炎表面抗原与甲胎蛋白等。
3．中和试验。
特异性抗体可抑制相应抗原物质的活性，抗体使相应抗原的毒性或传染性消失的反应为中和试验。例如抗毒素中和外毒素的毒性，病毒的中和抗体可使病毒失去感染性等。诊断风湿热的抗链球菌溶血毒素“O”试验也为一种中和试验。乙型溶血性链球菌能产生一种溶解人、兔红细胞的溶血毒素“O”，该毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素“O”抗体所中和而不出现溶血。试验时将病人血清与溶血毒素“O”混合，作用一段时间后加入人红细胞，红细胞不被溶解为阳性反应，表示病人血清中存在抗溶血毒素“O”抗体。血清抗体效价达400单位以上时提示患者曾感染乙型溶血性链球菌，有助于风湿热的诊断。
4免疫荧光法（荧光抗体法）。
是应用荧光素染料（如异硫氰酸荧光黄等）来标记抗体，但不影响其活性，此种抗体称荧光抗体。用已知种类的荧光抗体浸染待检的含有抗原的细胞或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原即与此种抗体发生特异性结合，形成复合物而粘着在细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下成为发出荧光的可见物，可达到诊断或定位的目的。包括直接法和间接法。
5．酶联免疫吸附试验。
本法的原理是利用酶（常用辣根过氧化物酶）标记的抗原或抗体，以测定被检标本中有无相应的抗原或抗体。有间接法、双抗体法、竞争法三种。
6．溶血空斑试验。
7．免疫印迹技术。
免疫印迹或免疫转印技术(immunoblotting或Westernblot）是在Southern(1975)
抗体抗原反应
创建的DNA印迹术(Southernblotting）基础上发展起来的新型免疫生化技术。
细胞免疫检测法
近代免疫学广泛采用了细胞生物学、免疫血清学、免疫标记、免疫组化等多方面技术，不断发展和完善了一系列细胞免疫检测技术，用于检测各类免疫细胞的表面标志（包括抗原及受体）、细胞的活化、增殖、吞噬、杀伤功能、各种细胞因子的活性或含量等方面。这些技术为深入研究和认识机体免疫系统的生理、病理改变，阐明某些疾病的发病机制和临床诊治提供了有用的手段。随着细胞免疫学的迅猛发展，时有新的细胞免疫检测技术出现。二十一世纪初期，新发展的项目集中在对有关细胞因子以及细胞受体方面的检测。
1．淋巴细胞转化试验。
人类淋巴细胞在体外与特异性抗原（如结核菌素）或非特异性有丝分裂原（如植物血凝素，PHA）等一起孵育，T细胞即被激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最后导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴母细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪来确定掺入量以确定淋巴细胞转化率。2000年开始出现一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法。MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色成分。该产物的多少与活细胞数成正比，结果可用酶标仪(595nm）测量光密度，作为MTT法的指标。
2．E-花环法。
人类T细胞表面有羊细胞受体(CD2）能与羊红细胞结合形成玫瑰花样结构。即将分离液分离出的外周的单个核细胞悬液与羊红细胞在体外混合，经37℃培养5～10分钟后放4℃过夜，取细胞悬液计数，外周血淋巴细胞中约70%～80%淋巴细胞结成花环即为T细胞，此法可用来分离T细胞。
3．T细胞亚群检测。
4．细胞毒试验。
Tc细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞等对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。
抗体制备
常用的检测方法是51Cr（铬）释放法，将51Cr-Na2CrO4盐水溶液与靶细胞（不同的细胞需不同的靶细胞，如NK细胞的靶细胞为K562），于37℃培养1小时左右，51Cr即进入靶细胞，与胞浆结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待测细胞毒的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50:1或100:1），靶细胞杀伤越多，释放到上清液中的游离51Cr就越多，且不能再被其他细胞吸收，用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，可计算出待检细胞杀伤活性高低。细胞毒的检测对肿瘤免疫有较大价值。
5．巨噬细胞吞噬功能的测定。
将中药(10%斑蝥）乙醇浸出液浸渍的滤纸（1cm2大小）置于受试者前臂屈侧皮肤上，4～5小时后取下滤纸。48小时内皮肤局部可水泡，内含巨噬细胞。取水泡液05ml加鸡红细胞悬液001ml，37℃经30分钟后作涂片、染色与镜检，计算吞噬百分率及每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。本试验有助于肿瘤病情及疗效的观察。
6．移动抑制试验。
致敏淋巴细胞与其特异性抗原再次接触时，可以产生移动抑制因子(MIF）。这种因子可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的移动，使之定位于局部而增强其免疫作用。本试验用来观察受检者淋巴细胞在体外受特异性抗原刺激后，有无MIF产生，以测定机体对某种抗原的特异性细胞免疫反应的功能。
7．时间分辨荧光测量技术。
时间分辨荧光测量技术(time-resolvedfluorometry,TrF）是一项新型的超微量非放射性分析技术。该技术的敏感性和特异性与放射性核素测量技术相仿，但无放射测量的弊端，故问世虽短，进展却极为迅速，有取代放射测量之势。
8．细胞因子检测技术。
细胞因子的检测，2005年起在中医临床及实验室中已广泛应用。
9．细胞受体的检测。
受体是细胞表面标志之一，通过对受体的检测，可以了解细胞的功能，并为某些疾病的发病机制提供一定的理论依据。

免疫力检查主要是看临床表现和免疫功能的实验室检测。轻的免疫力降低，主要靠临床表现来判断；重的免疫缺陷则主要依靠实验室检测。

免疫检查

免疫力检查是怎么回事？免疫力的评估主要靠两方面，一是临床表现，二是免疫功能的实验室检测。

1、较轻的免疫力降低，主要靠临床表现来判断。当人体免疫功能失调，或者免疫系统不健全时，感冒、扁桃体炎、哮喘、支气管炎、肺炎、腹泻、过敏等疾病就会反复发作，此时最好就医检查宝宝的免疫力了。

其次，医生也可能会让宝宝做一些化验，包括 免疫五项 、化验查血锌铜等 微量元素检测 、以及 血常规 。

2、重的免疫力低下，也就是医学所说的免疫缺陷。免疫缺陷可以通过实验室检测出来，并且检测的实验室指标是客观的。通过细胞免疫、体液免疫、吞噬功能等三方面的检测，80%的免疫缺陷都可以被发现。免疫缺陷主要有三大临床表现：反复感染、易发生自身免疫性疾病、易患恶性肿瘤。这与一般意义上的免疫力低下，也就是人们常说的“容易生病”不同。

需要说明的是，宝宝的免疫力不能单纯以是否“容易生病”或者感染的次数多少来衡量。以感冒为例，不能说1年患10次感冒的宝宝就比1年患1-2次感冒的宝宝在免疫力方面有问题。一般情况下，正常人感冒通常3-5天就好了，而免疫力有问题的人往往不易恢复，可能还会发展成肺炎；正常人感冒，用几天药后就好了，而免疫力有问题的人治疗效果差。另外，反复发生中耳炎、反复皮肤感染、其他反复感染，影响到生长发育，要注意有免疫力问题。

免疫五项

免疫五项：包括 IgG、IgA、IgM、IgE、IgD的正常值及增高和降低的意义，可以了解宝宝免疫方面的状况。

项目 正常值 增高 降低 血清免疫球蛋白G（IgG） 6-16g/L 慢性肝病、结缔组织疾病等。 蛋白丢失性肠病、肾病综合征、混合性免疫缺陷综合征、遗传性或获得性抗体缺乏症等。 血清免疫球蛋白A（IgA） 760-3900mg/L 慢性肝病、亚急性或急性感染性疾病、自身免疫性疾病等。 反复性呼吸道感染、肾病综合征、自身免疫性疾病、免疫抑制剂治疗或妊娠后期等。 血清免疫球蛋白M（IgM） 400-3450mg/L 肝炎、类风湿性关节炎、结缔组织疾病、慢性或亚急性感染等。 蛋白丧失性胃肠炎、混合性免疫缺陷综合征、遗传性或获得性抗体缺乏症。 血清免疫球蛋白D（IgD） 1-4mg/L 慢性感染、结缔组织病、某些肝病、葡萄菌感染等。 遗传性或获得性IgD缺乏综合征、重症复合性免疫缺陷症等。 血清免疫球蛋白E（IgE） 01-09mg/L 某些变态反应性疾病（如血清病、变应性亚败血症等）、哮喘、寄生虫感染、T细胞功能不全症、急性肝炎、肝硬化、风湿性关节炎、小儿腹泻等。 复合性免疫缺陷病、无γ-球蛋白血症等。

其他免疫检查详解

微量元素检查 ：人体健康与体内微量元素的含量密切相关，儿童时期微量元素的缺乏可以导致生长发育迟缓，免疫功能下降等。

铜：国外曾有报道，机体内铜总量减少，可减弱免疫机制(抵抗疾病力量)，降低抗病能力，助长细菌感染，从某种意义上说，微量元素比维生素对机体更需要。铜缺乏可以导致长期反复感染。铜主要参与造血及酶的合成，儿童缺铜也可导致贫血、发育迟缓等。

铁：婴幼儿在生长发育过程中，非常容易出现缺铁问题，缺铁会使血红蛋白合成降低，引起缺铁性贫血。铁参与构成血红蛋白，运输和储存氧。由于铁是制造Hb的原料，不足可使Hb合成量减少，婴幼儿由于生长发育迅速所致铁供应不足可引起贫血。儿童缺铁可引起缺铁性贫血，从而影响生长发育。

锌：锌也是人体重要的必需微量元素之一，小儿缺锌的主要表现为食欲差、生长发育缓慢、免疫功能降低。

镁：镁是维持机体代谢的重要微量元素，是机体代谢的重要催化剂，几乎参与人体的所有新陈代谢过程，儿童缺镁能引起蛋白质合成系统的停滞，荷尔蒙分泌的减退，消化系统机能异常，脑神经系统障碍等，获得镁的最好办法是多吃绿色蔬菜、胡萝卜、面粉等，常喝硬水。镁能激活多种酶，儿童缺镁容易感到疲劳，免疫力下降。

钙：钙是骨骼和牙齿的主要成分，钙在维持肌肉兴奋、酶的激活中起重要作用。儿童缺钙可导致儿童佝偻病、生长停滞、骨软化症等。儿童处于生长发育快速期，膳食结构不合理或儿童偏食、挑食可导致缺钙。因此，在学龄前对儿童进行合理的补钙是非常必要的。在补钙过程中，补充维生素AD非常有必要，这样可以保证钙质的最佳吸收和利用

血常规 ：血常规化验是了解宝宝免疫力的化验项目之一。血红蛋白的减少可能代表贫血，缺铁性贫血可引起细胞免疫功能缺陷。

补体的检测

补体的检测包括总补体 (CH50)、补体C3（正常值为085-200g／L）、C4（012-040g/L）、B因子、补体组分裂解产物（C3c、C3d、C3a 、 C4a 、 C5a 、Ba 和 C5b-C9 复合物等补体裂解片段）、C1 抑制物（诊断遗传性血管神经性水肿）等。补体系统异常包括先天异常和后天异常，前者见于遗传性血管神经性水肿、补体各个单一组分缺陷病等。后者分补体含量增多和降低，增高见于部分感染性疾病早期，降低的原因有：

1、免疫机制激活而消耗了补体：如系统性红斑狼疮活动期、急性肾小球肾炎早期、系统性红斑狼疮伴肾病者、高球蛋白血症等；

2、补体合成减少，如某些慢性肝病、小儿进行性肾小球肾炎等。

补体检测临床意义

补体C3 ：C3是补体系统中含量最多、最重要的一个组分，它是补体两条主要激活途径的中心环节，有着重要的生物学功能，因此对C3的研究日趋重视。

补体C4 ：C4是补体经典激活途径的一个重要组分，它的测定有助于SLE等自身免疫性疾病诊断，治疗和病因探讨。

血清总补体溶血活性（CH50）测定 ：补体是存在于正常人新鲜血清中的一组不耐热、具有酶活性的、比较复杂的血清蛋白。补体是一个多种血清蛋白组成的复杂系统。它除了具有溶血作用和一定的杀菌作用外，还可以促进炎症反应，参与一些变态反应和自身免疫性疾病的病理过程。补体并不随机体的免疫反应增加而升高，只有在疾病情况下才出现波动。

要机体发生炎症时，补体值可以增高，但在多种自身免疫性疾患和变态反应性疾患，补体值往往下降。因此，临床上动态观察补体值的变化，以这一类疾病的诊断、病因研究及预后判断有重要意义。

项目 正常值 增高 降低 补体C3 112 ±055mg/L（101-186） 见于各种传染病及组织损伤和急性炎症，肝癌等。 主要见于免疫复合物引起的肾炎、系统性红斑狼疮、反复性感染、皮疹、肝炎、肝硬化、关节疼痛等。 补体C4 0553±0109mg/L（016-047） 见于各种传染病、急性炎症、组织损伤、多发性骨髓瘤等。 见于免疫复合物引起的肾炎、系统性红斑狼疮、病毒性感染、狼疮性症侯群、肝硬化、肝炎等。 血清总补体溶血活性（CH50）测定 50-100kU/L（CH50） 血清补体值增高：可见于许多炎症疾患以及阻塞性黄疸、糖尿病、急性风湿热、皮肌炎、甲状腺炎、结节性结肠炎、菌血症、急性心肌梗塞、各种传染病、肺炎、肿瘤等。 补体减低：见于免疫复合物引起的肾炎、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、病毒性肝炎、肝硬化、休克、异体移植排斥反应、痢疾的反复发作、桥本氏甲状腺炎等。

细胞免疫检查

细胞免疫检查：参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞检查。包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞、辅佐细胞，以及它们的前体细胞等。主要有淋巴细胞转换试验、FBC玫瑰花试验、T淋巴细胞亚群、淋巴细胞毒试验和NK细胞活性测定。

异常结果：

1、T淋巴细胞：可用于T淋巴细胞计数，T淋巴细胞亚群的分类以及判断T淋巴细胞的活化程度。CD3分子表达于所有成熟T淋巴细胞的表面，是总T淋巴细胞的重要标志，CD3+常见于甲状腺功能亢进、淋巴细胞性甲状腺炎、重症肌无力以及器官移植后排斥反应。主要见于免疫缺陷病，如AIDS、先天性胸腺发育不全综合征以及联合免疫缺陷病等。亦可见于恶性肿瘤、SLE、免疫抑制剂治疗等。

2、B淋巴细胞：SmIg+细胞增高：常与B细胞恶性增殖有关，主要见于慢淋、毛细胞白血病以及巨球蛋白血症等。SmIg+细胞减低：主要与体液免疫缺陷有关，常见于性联丙种球蛋白缺乏症、严重联合免疫缺陷病等。

需要检查的人群：免疫力低下者和细胞免疫有缺陷者均可检查。

细胞免疫检查正常值一般呈阴性结果。有些试验则是在一定的参考值范围内。

免疫球蛋白

免疫球蛋白G

正常值IgG844-1912g/L

临床意义

1年龄与血中Ig含量有一定关系。

2免疫球蛋白异常

（1）低Ig血症：有先天性和获得性二类。先天性低Ig血症，主要见于体液免疫缺损和联合免疫缺陷病。一种情况是Ig全缺，如Bruton型无Ig血症，血中IgG<1g/L，IgA与IgM含量也明显降低。另一种情况是三种Ig中缺一或二种。最多见的是缺乏IgA，患者易患呼吸道反复感染;缺乏IgG易患化脓性感染；缺乏IgM易患革兰阴性细菌败血症。获得性低Ig血症，血清中IgG<5g/L，引起的原因较多，如有大量蛋白丢失的疾病（剥脱性皮炎、肠淋巴管扩张症、肾病综合征）；淋巴网状系统肿瘤（淋巴肉瘤、何杰金病）；中毒性骨髓疾病等。

（2）高Ig血症感染：各种感染，特别是慢性细菌感染可使Ig升高。如慢性骨髓炎、慢性肺脓肿，血IgG可升高。子宫内感染时脐血或生后两日的新生儿清中IgM含量可>02g/L或>03g/L。自身免疫病、肝脏疾病（慢性活动性肝炎、原发性胆汗肝硬变、隐匿性肝硬变）患者可有3种Ig升高。慢性活动性肝炎IgG和IgM升高明显。各种结缔组织病中常见Ig升高。SLE以IgG、IgA或IgG、IgM升高较多见;类风湿性关节炎以IgM增高为主。

M蛋白血症：主要见于浆细胞恶性病变，包括多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症等。

免疫球蛋白A

正常值06-34g/L（浊度计法）。

分析变异浊度计法分析变异系数CV=8%。

生物学变异

1升高社会—经济学因素（黑色人种）约可升高20%-75%，60-80岁老人约升高15%-60%，雨季较旱季约高20%。锻炼约升高14%，冬季较夏季约高10%-14%。肥胖女性约升高30%，男性约升高4%-30%。

2降低新生儿显著减低达98%-100%，3-5岁儿童约低50%，口服避孕药约降低11%-40%，妊娠约升高20%

药物影响

L-门冬酰受酶通过增加肝脏合成IgA的作用约升高30%-60%，嗜酒者如继续饮酒可导致IgA升高。

甲基强的松龙致43%病例的IgA明显降低。甲苯、二甲苯和苯的职业接触者其IgA明显降低，嗜酒者戒酒一年以后可降低。右旋糖苷导致IgA降低。

病理学变异

1升高见于多发性骨髓瘤，α-重链病、良性低蛋白血症、酒精性肝硬化、活动性慢性肝炎、多发性硬化、风湿病、感染性疾病和接种。

2、降低见于小肠病、肾脏病、癌、夸希奥科营养不良、医源性低丙种球蛋白血症、原发性低丙种球蛋白血症和无γ-球蛋白血症。

免疫球蛋白M

正常值IgM05-196g/L

免疫球蛋白D

正常值IgDxxg/L

IgD的生物学功能未完全阐明。妊娠末期、大量吸烟者、IgD型骨髓瘤患者血清中IgD含量升高。

免疫球蛋白E

正常值IgExxg/L

变态反应性疾病、寄生虫感染、急性或慢性肝炎、IgE骨髓瘤、SLE、类风湿性关节炎患者血清IgE含量升高。

体液免疫检查

体液免疫主要是由B细胞承担，反映体液免疫的项目有B细胞及其亚群计数、B细胞分泌的免疫球蛋白或自身抗体水平、补体及循环免疫复合物水平测定等。

（一）B 细胞及其亚群计数

由于淋巴细胞表面有一种抗原称为CD抗原或CD分子（已发现130余种），不同的淋巴细胞类型有不同的CD抗原。通过采用单克隆抗体以免疫荧光技术检测各群淋巴细胞的CD 抗原来计数淋巴细胞的数量。B细胞表面抗原为CD19 或 CD20。根据B细胞产生抗体时是否需要T细胞辅助分为B1（标记为CD5+CD19+ ）和B2（标记为CD5-CD19+）细胞。前者为T细胞非依赖性细胞，产生低亲和力的IgM、IgA和IgG3抗体，参与抗细菌感染的黏膜免疫应答，还能产生多种针对自身抗原的抗体，与自身免疫病相关;后者为T细胞依赖性细胞，可产生高亲和力抗体，是参与体液免疫应答的主要B细胞，还有抗原提呈和免疫调节功能。外周血中B1细胞和B2细胞的百分比正常值分别为（0-0964%）和（145%-949%）。研究显示，系统性红斑狼疮患者的外周血B1淋巴细胞亚群的百分比、B1/B2淋巴细胞亚群比值显著高于正常对照，B1淋巴细胞亚群与狼疮活动性显著相关。

（二）B 细胞功能检测

1免疫球蛋白 （Ig） 测定：（1）IgG、IgA、IgM 定量检测：用散射比浊计进行测定的血清免疫球蛋白正常值为：IgG 694-1618g/L，IgA07-38g/L，IgM 06-262g/L。高于正常值为B细胞功能亢进，低于以下值为B细胞功能缺陷：IgG<25g/L，IgA<（005-01）g/L，IgM<（005-01） g/L。表1列举不同疾病的血清 IgG、IgA和IgM水平变化。（2）IgE的检测：包括IgE 总量测定和过敏原特异性 IgE检测，前者正常值为0-100IU/ml，数值与年龄相关，因过敏与非过敏者的总 IgE 水平有较大交叉，因此总 IgE 测定对于筛查过敏性疾病的意义不大。但也有资料显示婴幼儿总 IgE 增高患过敏性疾病的可能性增大，成人总 IgE 水平低（< 50 mg/L）患过敏性疾病的可能性小。过敏原特异性 IgE检测为检测针对某种过敏原的特异性 IgE 类抗体含量。经典测定法为放射性过敏原吸附试验（为体外检测血清过敏原特异性 IgE），也可用皮肤试验或点刺法。放射性过敏原吸附试验适于：①严重的皮炎及皮肤划痕症阳性患者;②皮肤试验可能激发过敏性休克者;③有毒、非水溶性或高度致敏作用的抗原;④食品过敏原等。皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应的两种常用方法。

2特异性抗体应答反应 主要是检测机体接触各种病原抗原后产生抗体的能力。免疫缺陷的患者抗体产生能力低下或缺如。

（三）自身抗体检查

自身抗体是B细胞针对自身抗原成分所产生的对自身组织或器官起反应的抗体，自身抗体可以针对细胞内成分也可以针对细胞外成分。根据影响的范围，自身抗体可以分为器官特异性和器官非特异性自身抗体。

1器官非特异性自身抗体

（1）类风湿因子（RF）：是抗人类多克隆 IgG Fc 段的自身抗体。一般实验室检测的类风湿因子是 IgM 抗体 。因为类风湿因子最先在类风湿性关节炎病人血清中检测到，故得此名称。一般正常人类风湿因子滴度为 1：80 。需要强调的是即便存在类风湿因子，甚至是高滴度的，也不能做为诊断类风湿关节炎的特异性依据。约 1%-5% 健康人群体内存在类风湿因子。

（2）抗核抗体（ANA）：抗核抗体是以细胞的核抗原为靶抗原的自身抗体的总称。使用不同的血清稀释度（滴度）可以对血清中抗核抗体行半定量。结果以阳性（滴度）、阴性表示。还可描述荧光图谱，如均质型、周边型、斑点型、核仁型等，各型提示存在不同种类抗体。抗核抗体通常作为各种针对核抗原的不同抗体的筛查实验。抗核抗体检测是诊断系统性红斑狼疮等结缔组织病的重要实验室依据。

（3）抗双链DNA抗体（ds-DNA 抗体）：是诊断系统性红斑狼疮的特异性抗体，抗体滴度还与疾病的严重程度相关，有助于临床诊断、判断预后以及了解系统性红斑狼疮的活动程度。

（4）抗可提取核抗原（extractable nuclear antigen，ENA ）抗体：血清中针对一组水溶性、可使用盐水提取的核抗原成分的抗体。抗ENA 抗体是诊断自身免疫病有效的实验室检测（表 3 ），包括对系统性红斑狼疮、系统性硬化症、多发性肌炎、皮肌炎、混合性结缔组织病、干燥综合征和重叠综合征等的诊断。

（ 5）抗 Sm 抗体：对诊断系统性红斑狼疮具有高度特异性，但诊断时系统性红斑狼疮病人只有15%-30%呈阳性，与病情活动无关。亚裔和非洲裔阳性率比白种人高。

（6）抗核糖核蛋白（U1RNP）抗体：是混合性结缔组织病的特征性抗体。系统性红斑狼疮 和系统硬化症患者血清中也可阳性。

（7）抗SSA和抗SSB抗体：两者常同时存在，是干燥综合征的特征性抗体。 系统性红斑狼疮病人也可存在上述两种抗体，尤其是明显对光敏感而无肾损害的病人。此外，新生儿狼疮综合征也可出现抗 SSA 和 / 或 SSB 抗体。

（8）抗 Jo-1 抗体：是针对组氨酰-tRNA 合成酶的抗体。与皮肌炎关系较密切。虽然仅 25%-30%的皮肌炎病人抗 Jo-1 抗体阳性，但具有较高特异性。在合并有间质性肺部疾病的皮肌炎患者抗Jo-1 抗体阳性率较高。

（9）抗 Scl-70 抗体：是针对DNA 拓扑异构酶 I的抗体，与弥漫性系统性硬化症关系最大，阳性率约 30%。

（10）抗组蛋白抗体：与药物性狼疮相关。

（11）抗中性粒细胞抗体（ ANCA）：主要有2种免疫荧光类型，即分布于细胞浆 （cANCA） 和分布于细胞核周围 （pANCA）。cANCA 与 Wegener's肉芽肿有关，滴度与临床表现严重性相关。

（12）抗心磷脂抗体：约40%的系统性红斑狼疮患者抗心磷脂抗体阳性。

2器官特异性自身抗体

此类抗体较多，而且不断有新的抗体被发现和应用于临床。由于仅仅是针对特定组织或器官抗原产生的抗体，所以这类抗体主要与相对应的组织器官起反应，引起这些组织器官的损害。一般这类抗体在诊断相应的疾病中具有重要的价值，尤其是存在高滴度抗体时。

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