NGS007 华大MGI测序

NGS006 illumina测序

华大智造基因测序仪采用先进的DNBSEQTM测序核心技术，主要包括:DNA单链环化，DNB制备，规则阵列芯片（Patterned Array），DNB加载，cPAS（combinatorial Probe Anchor Synthesis联合探针锚定聚合测序法）,双端测序技术，CoolMPS，以及配合的流体和光学检测技术和碱基识别算法等。

以单链环状DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行滚环扩增（Rolling circle amplification, RCA），将单链环状DNA扩增到约500拷贝扩增产物称为DNB。基于RCA的线性扩增技术，每次扩增都是以原始的DNA单链环为模板，使用保真性极高的聚合酶（phi29 DNA polymerase），使得在DNB的所有拷贝的同一个位置上出同样的错的几率几乎是零。RCA扩增技术有效的避免了PCR扩增错误指数积累的问题，从而大大提高测序的准确性

将带有接头序列的双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA），通过高温变性形成单链DNA （single-stranded DNA，ssDNA），环化引物与ssDNA的两端互补配对，在连接酶的催化下，ssDNA的首尾相连接，形成单链环状DNA。

通过RCA扩增，可以将1copies原始ssCirDNA文库分子扩增得到约500copies

采用先进的半导体精密加工工艺，在经过修饰的硅片表面形成结合位点阵列（spot直径约200nm），实现DNA纳米球（约220-240nm）的规则排列吸附。阵列芯片修饰位点的间距均一（约700nm），每个位点只固定一个DNB，可保证不同纳米球的光信号不会互相干扰，这不仅保证了测序准确度，而且提高了测序芯片的利用效率

DNB在酸性条件下带负电，在表面活化剂的辅助下，通过正负电荷的相互作用，被加载到芯片中有正电荷修饰的活化位点（直径约200nm）的过程，称为DNB加载。DNB直径略大于芯片上活化位点的直径，避免了多个DNB结合到同一个位点的情况

DNB含有约500 DNA fragment copies，也即可以与500条Read1引物退火结合，进行一链cPAS测序。

以华大测序反应通用试剂盒为例（环化部分）

使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit或 Quant-iT PicoGreen® dsDNA Assay Kit等双链 DNA荧光定量，按照定量的 *** 作说明对 PCR纯化后产物进行定量。要求最终 PCR产 物的摩尔量≥1 pmol，请参照如下公式 1进行计算，例如 ：主带 300 bp的打断产物 ，PCR产物主片段大小产物主片段大小 384 bp，其产量应达到产量应达到 250 ng。如需将多个样本混合测序，建议根据 MGIEasy DNA Adapters说明书使用规则设计混合方案（参照附录 B），在定量后进行不同 Adapters样本混合，样本混合后总量为 1 pmol，总体积 ≤48 μL。

1 pmol PCR产物对应的质量（ng）=（DNA主片段大小/bp）/1000bp×660ng

通过 Bioanalyzer、Tapestation (Agilent Technologies)；LabChip® GX、GXII、GX Touch

(PerkinElmer)；Fragment AnalyzerTM (Advanced Analytical)等基于电泳分离原理的设备对 PCR 纯化后产物进行片段分布检测。

-在步骤 3.10.3 反应时，提前在冰上配制酶切消化反应液

使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 荧光定量试剂盒，按照定量试剂盒的 *** 作说明对酶切消化纯化后产物进行定量。最终要求酶切消化产物产量（ssDNA）/ PCR 投入量（dsDNA）≥7%。例如：主带 300 bp 的打断产物，PCR 产物主片段大小为 384 bp，投入 250 ng 进行环化，其酶切消化产物产量应不少于 17.5 ng。

-初始文库 DNA 浓度≥ 2fmol/µL，文库需用 Qubit® ssDNA HS Assay Kit 和 Qubit® Fluorometer定量，根据定量的结果计算投入量。

-注：投入体积 V（μL）=N×330 g/mol×40 fmol/(1000×1000×C)

-N 表示核苷酸数目（文库总片段长度），C 表文库浓度ng/μL

英文缩写DNB的英文全称查询结果是Diplomate of the National Board of Medical Examiners,中文意思是 全国理事会专科医师医学。

---