Ion Torrent 基因分析仪——介绍及原理

IonTorrent基因分析仪组件：

IonTorrent与Illumina原理的主要区别：

Illumina：荧光信号

Ion Torrent：电信号

IonTorrent 核心理念：

核心理念：芯片就是测序仪

特点：扩展性、简捷、快速

半导体测序技术：

IonTorrent生物化学原理：

IonTorrent如何快速、直接检测：

Ion系列测序平台适用的chips及数据产出情况汇总：

PGM Chip：

314 Chip：1.2M Wells

316 Chip：6.1M Wells

318 Chip：11M Wells

Ion torrent测序过程：

Follow 和Cycle的含义：

一个“Follow”：将一个特定的dNTP(T, A, C, or G)打入芯片，随后进行洗脱；

一个“Cycle”：是由4个dNTP组成，例如：A-T-C-G= 1 Cycle。

测序时“Follow”的顺序是怎样的？

“Flow”的顺序是以下dNTP顺序的重复（参数可调）：

“TACG-TACG-TCTG-AGCA-TCGA-TCGA-TGTA-CAGC”

IonTorrent 测序记录“Ionograms”：

An “ionogram”代表信号的输出

必须“从上到下”和“从左向右”读

柱的高度代表在一个“Flow”中有几个核酸结合上去

“Negative ” 或 “zero” flows 代表没有核酸结合上去

IonTorrent实验流程汇总：

IonTorrent特点：

1.扩展性   :灵活高效的Ion Torrent

2.简捷：简单而又真实的生物化学原理

3.快速：最快速的 *** 作流程

IonTorrent应用与产品化：

提供快速鉴别与筛查食源性致病菌的整套工具

微生物全基因组测序— de novo 测序和重测序；

宏基因组测序（16S/18S…）—一项有效的工具；

RNA病毒测序：

1.纯化的RNA病毒分型

–病毒RNA抽提

–长PCR扩增子

–短PCR扩增子(利用AmpliSeq技术)

–TargetSeq捕获

2.未知的RNA病毒 denovo分析

–病毒RNA抽提

–反向富集，去除rRNA专有引物设计，去除宿主rRNA

Ion Total RNA-SeqKit (48 reactions)

•构建全外显子或Small RNA文库；

•维持原始单链并减少偏向性和错误；

•低起始量建库：总RNA 200ng或5ngmiRNA。

目标区域：

1.扩增子测序

基于PCR目标序列的深度测序，用于检测变异}扩增子的长度是可变的，

Ion Xpress™ 文库制备试剂盒与现有的Sanger测序法的引物完全兼容

利用barcoding试剂盒（条码试剂盒），可以实现多种样品的扩增子同时测序

检测生殖细胞和体细胞的突变

2.捕获目标序列 (目标序列>100kb)

通过杂交法或大量并行的PCR，实现目标序列的富集

•TargetSeq™定制富集试剂盒，可根据客户应用需求实现特定序列的富集

•可与其他富集方法兼容

Ion DNA 条码接头（Barcode Adaptor ）1-96试剂盒

1.Ion半导体测序技术采用优化的barcodes可以 一次进行多达96种文库的同时测序。

2.支持多种文库的目标序列或全基因组的再测序，可以降低成本，节省样品。

3. 最少的接头序列和强大的校正功能确保样品种类的确认

4. 兼容自动化 *** 作

微生物测序

准确，快速的细菌和病毒的从头测序和重测序

线粒体测序

多重线粒体测序用于科研，临床和法医等应用

扩增子测序

•多重扩增子测序用于快速的检测生殖细胞和体细胞的突变

•与毛细管电泳测序的引物完全兼容

•利用测序进行基因分型

•细菌和病毒的分型质粒测序

大片段目标序列（>100kb）的在测序

快速，简单的 *** 作流程适用于所有的大片段目标序列的富集方法

验证全基因组和显子组的突变

正交技术验证SOLiD®System/Illumina的全基因组和外显子组的测序结果

文库评估

在进行高通量的测序之前，对构建的文库进行快速的复杂性验证或QC质控

RNA测序

快速，简单的RNA测序解决方案（最初主要针对于小RNA&低复杂度的转录组）

IonTorrent数据处理：

Ion Torrent下机数据格式（SFF、BAM、Fastq）

默认下机文件类型为：BAM；

通过插件FastqCreator可下机直接生成：Fastq；

原始下机数据路径：

Fastq格式文件：/results/analysis/output/Home/（ReportName）/plugin_out/FileExporter_out.*

BAM格式文件：/results/analysis/output/Home/（ReportName）

IonTorrent测序质控：

Positive-controlKit，上机制备模板时加入；

可自行设置，占据上样量；

IonTorrent上机情况反馈

机器运行及分析的日志文件压缩包（Support文件）。

第二代测序技术又称为下一代测序（NGS），与第一代相比主要是1.高通量测序2.边合成边测序。

回顾二代测序的发展史

1996年Ronaghi和Uhlen发明了焦磷酸测序，454 Life sciences 公司基于此原理推出了测序系统Genome Sequencer 20System，标志着二代测序的商用；

2006和07年 Solexa和ABI公司推出了GA SOLID测序平台

2010年Life Technologies 推出Ion PGM系统

2014年华大推出了BGISEQ-1000

1.Illumina/Solexa测序平台

之前也总结过Illumina测序的原理，现简要梗概一下其步骤

1）DNA文库准备：先将DNA链打断成200-500bp的片段，末端修复后在两端连上特异性的接头

2）流动槽杂交：

带有接头的DNA片段流过流通池，与其上固定的种接头通过互补配对结合。这些固定的接头其后充当引物的作用，在聚合酶的作用下进行合成反应。

3）DNA合成后，变性使得未与流动池共价连接的DNA链解离并洗掉，反向练则以共价键结合在流动池的表面。因为DNA单链另一端也含有接头，能够和临近的接头互补，DNA链形成桥式结构，同样的这个相邻的接头充当引物，在DNA聚合酶的作用下， 合成双链桥式结构。重复此过程，形成5000-10000个copy。这个目的是形成序列相同的DNA簇，使得在测序的过程中产生足够强的信号。变性打开，各自形成单链的DNA链固定在表面。将反向链切除，将正向链的的3‘封闭，以免产生不必要的DNA延伸。

4）DNA测序：加入测序引物，DNA聚合酶，4种带不同荧光标记的dNTP，且这些dNTPde3’端羟基被封闭，无法继续下一个反应。计算机检测到荧光的信号后，将不同的信号转化为对应的碱基。加入化学试剂淬灭信号，并去除3’的保护基团，并进行下一个碱基的反应。

illumina测序一般能够检测150个碱基左右，因为在后续，由于DNA合成酶活力下降等原因，造成相同序列的DNA信号不一致，DNA测序的准确性下降。

在实际的测序过程中，通常一次性会测不同物种来源的DNA，此时，需要barcode来进行标记。不同的物种带有不同的barcode序列，在DNA测序完成后，需要加入barcode引物，将barcode也进行测序。

该测序系统基半导体测序原理，不需要进行光学感应。

原理简要概括如下：

在测序的过程中，识别不同的碱基不是依靠荧光信号，而是通过dNTP结合释放的H+。

更多的信息详见 7种测序平台 - Thinkando - 博客园 (cnblogs.com)

补充：

罗氏454测序

罗氏454的焦磷酸测序是最早发行的二代测序。其测序的文库的建立和Ion Torrent相似，一个磁珠吸附一个模板DNA，充当一个微型的反应器。外面裹以油，将不同的液滴隔离开来。不同的片段平行扩增，待反应结束后，破坏乳液，只剩下磁珠。此时一个磁珠=一条读长。

将磁珠放在PTP板中测序，依次加入ATCG四种碱基。让碱基能够成功配对时，会释放一个焦磷酸。

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