请大家告诉我狗和狼有什么相似处

美国《科学》杂志近日刊登西雅图弗雷德·赫奇逊癌症研究中心科学家的最新研究报告称，狗与狼在基因上有很多相似之处，而且不同品种的狗在基因方面存在显著差异，科学家们正准备利用基因技术，为狗绘制准确的家谱。

美国科学家对85个品种414只纯种狗的基因进行分析后发现，最古老的狗的品种多半起源于亚洲和非洲，它们与狼有密切的亲缘关系，包括中国的哈巴狗和沙皮狗、日本的秋田犬、阿富汗猎犬、西伯利亚雪橇犬等等。研究表明，起初可能有两组古老品种的狗从狼的家族中分离出来，后来进一步发展出猎犬、牧羊犬和看门狗三大类。

另一些“古老”品种实际上并不老。法老猎犬和依比赞猎犬与古埃及墓穴壁画上发现的狗很相似，因而一直被当作世界最古老的狗。但新的研究则显示，伴随法老们长眠的狗早已灭绝了，现在的法老猎犬是后来培育出的新品种。

研究显示，狗的品种确实存在基因基础与差异。科学家指出：“这些差异如此明显，以至于我们只要把一只狗的遗传特征数据输入数据库，计算机马上就能判断出它的品种。”

研究人员发现，所有的狗都有99％的基因是相同的，剩下1％的差异形成了400多个狗的品种。传统上被认为是不同品种的狗实际拥有完全相同的基因。例如，比利时特伏丹犬和比利时牧羊犬，阿拉斯加北极犬和西伯利亚雪橇犬。85个品种中还有4个品种的狗没有显示出基因上的品种内部一致性，这意味着它们可能需要进一步细分。

随着基因技术的发展，科学家们可以更详尽地追溯狗的起源和进化过程，为它们绘制更准确的家谱。有科学家指出，线粒体DNA分析表明，狗很可能起源于东亚，更具体地说或许是中国，起源的时间是大约1．5万年前。另有发现表明，美洲的狗并非土生土长，而是在1万多年前随原始人类越过白令海峡到达美洲。

用基因技术描绘狗的家谱并不仅是为了养犬爱好者的兴趣，狗至少与人类共同生活了上万年，会患多种与人相似的疾病。科学家可以用狗进行许多不能在人体上进行的试验，寻找癌症等疾病的病因和疗法。美国国家人类基因组研究所已于2002年将狗列入基因组测序的对象名单，狗的完整基因组图谱可望于今年夏天面世。

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式，它以蛋白质、核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构及其变异。目前在植物遗传育种研究中应用较多的是RFLP、RAPD、AFLP、SSR及SCAR等标记。这些分子标记方法在甘蓝种质资源及育种研究中得到较广泛应用，包括分子遗传图谱的构建，与其他芸薹属作物及拟南芥基因组的比较作图，重要性状连锁的分子标记、基因定位，遗传资源的进化、亲缘关系与分类研究，核心种质的构建等。

（一）分子标记在结球甘蓝种质资源研究及辅助育种中的应用

1分子标记在结球甘蓝遗传多样性研究中的应用

Phippen等（1997）利用RAPD技术分析了14份来源不同但表型与“Golden Acre”相似的甘蓝品种，发现这些材料可以归为4类，如果选择每一类作为一个样品来保存，每一个再生循环（大约20～25年）只会损失绝对变异的46%，而保存的费用却将减少70%。

李志琪、刘玉梅等（2003）采用AFLP分子标记技术对中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝组多年育成的52份结球甘蓝骨干自交系的亲缘关系进行研究。根据品种间DNA片段的差异，应用SPSS软件计算出样品间的相似系数SM。以欧氏距离作为类间距离，通过分层聚类的方法进行聚类分析，构建了聚类图（图10-26）。由图10-26可以看出，52份结球甘蓝自交系清楚地分为4个类群（A、B、C、D）。第一类群为春甘蓝自交系（A），包括4号（品种编号，下同）（084-73-3-1-1-4）、5号（C88-9-1-1-2-1）和44号（2000春根88-3）等共18个自交系。这些自交系都为圆球、早熟型春甘蓝。第二类群为紫甘蓝自交系（B），包括45号（98241-6-1-5）、49号（92850-3-1-10-3-1）、46号（93362-7-3-1）、48号（92440-4-1-1）及47号（98376-6-4-2）共5个自交系，均为圆球形紫甘蓝，其叶球紧实。第三类群为秋甘蓝自交系（C），包含37号

图10-26 依据AFLP标记的52份结球甘蓝自交系聚类图

（84101-1-2-5-1-4-1-）、29号（8498-2-1-2-1-1-）和18号（20-2-5-2-2）等共有26个自交系，该类群多为扁球、中晚熟类型秋甘蓝，该类群又划分为5个亚群。第四类群为来自台湾省结球甘蓝的自交系（D），仅包括50号（H2-2）、52号（351）和51号（F01-4）3个来自于台湾省的种质材料。这3个种质材料均为单球重较大、中熟、扁球类型。

表10-7所列为结球甘蓝自交系4个类群内及类群间的平均遗传相似系数。在所分的4个类群中A类群的平均遗传相似性系数最高为0809，说明A类群内各自交系之间的遗传距离最小，遗传背景最为狭窄。反之，C类群的平均遗传相似性系数最小，说明该类群的遗传背景相对较宽。

表10-7 52份结球甘蓝自交系各类群内及类群间平均遗传相似性系数

在各类群之间的关系中，A与B类群的平均遗传相似性系数最大（0691），说明春甘蓝自交系（A类群）与紫甘蓝自交系（B类群）之间的亲缘关系最近。紫甘蓝自交系（B类群）与春甘蓝（A类群）、秋甘蓝自交系（C类群）在亲缘关系的远近上几乎相同，而B与D类群的平均遗传相似性系数最小（0650），说明紫甘蓝自交系（B类群）与来自中国台湾省的自交系（D类群）的亲缘关系最远。

分子标记技术在甘蓝品种鉴定方面也得到了较广泛的应用。宋洪元等（2002）利用RAPD标记曾对17个结球甘蓝品种进行了分析。结果显示，所有品种经12个引物扩增后，发现利用其中4个引物在17个品种间扩增出的多态性标记可将17个品种鉴别开来。宋顺华等（2006）采用AFLP技术分析了来自全国9个栽培地区的44个甘蓝主栽品种，共筛选了40对E+3/M+3引物组合，多态性条带的数量从0条到15条不等。其中引物组合E-AAC/M-CTA是甘蓝品种中多态性最高的引物，有15条多态性条带，多态性条带的百分率为30%，同时筛选了11组E+2/M+3对引物组合，其中引物组合E-AG/M-CTC产生了13条清晰的多态性条带。以E-AAC/M-CTA和E-AG/M-CTC这两对引物组合的多态性条带构建了44份甘蓝品种材料的指纹图谱，此指纹图谱可以将供试的44份材料一一区分开。庄木等（1999）曾利用RAPD方法鉴定北方地区的春甘蓝主栽品种中甘11号和8398的纯度，实现了甘蓝一代杂种纯度的快速鉴定。田雷等（2001）利用AFLP方法对生产上大面积推广使用的5个甘蓝杂交种及其10个亲本进行了分析，对供试5个甘蓝杂交种进行真实性及品种纯度鉴定，取得了良好的效果。另外，刘冲等（2006）还将SRAP与ISSR 2种分子标记技术应用于8种甘蓝类作物（Brassica oleracea L）的种子鉴别。

2甘蓝分子连锁遗传图谱的构建

到目前为止，已构建的甘蓝类蔬菜分子连锁遗传图谱有十几张（表10-8）。从已构建的分子连锁遗传图谱来看，用于构建图谱的标记绝大多数为RFLP标记，其次是RAPD标记，还有少量的AFLP和同工酶标记等。所用构建图谱的作图群体大多都是利用变种间杂交后代，缺乏甘蓝品种间杂交后代分离的作图群体，且所构建的图谱大多是利用非永久性的F2群体构建，缺乏甘蓝品种间杂交后代分离的永久性作图群体。

表10-8 甘蓝类（Boleracea）蔬菜分子遗传图谱

甘蓝类最早构建的图谱是Slocum等（1990）利用普通甘蓝（Boleracea L）×花椰菜（Boleracea Lvarbotrytis）变种间F2群体构建的连锁图，图中含258个RFLP标记，覆盖基因组长度820cM。在此之后，甘蓝类蔬菜分子连锁图的绘制得到迅速发展。Landry等（1992）建立了一个由分散在9个主要连锁群、覆盖基因组长度1112cM的201个RFLP标记组成的Boleracea分子连锁遗传图谱。Kinian等（1992）利用亚种间杂种F2代构建了Boleracea分子连锁遗传图谱，得到了92个RFLP标记，16个同工酶标记，覆盖基因组长度747cM；Camargo等（1996）利用普通甘蓝（Boleracea L）×青花菜（Boleracea Lvaritalica）变种间F2群体构建了含有159个RFLP标记，长度为921cM的连锁图；随后，Cheung等（1997）利用变种间F2代构建Boleracea的连锁遗传图，长度达1606cM，包含了307个RFLP、RAPD、STS等标记，平均标记间距只有5cM。

在原有构建的分子连锁图的基础上，国外学者对Boleracea的连锁图进行了整合。在Hu等（1998）的研究中整合了4张已发表的图谱，先将Landry等（1992）和Camargo等（1997）构建的图谱中的RFLP标记整合到了Kianian等（1992）构建的图谱中，并整合了Ramsay等（1996）发表的图谱中与Camargo（1997）相同的标记，最后得到的连锁图图距有1738cM，是目前为止覆盖基因组最全面的Boleracea分子遗传连锁图；Sebastian（2000）将两个不同来源的DH群体的遗传图谱整合到一张图谱中，获得的连锁图包含的标记已达547个，覆盖基因组893cM，是目前报道的密度最大的一张遗传图谱。

目前公开报道的用甘蓝品种间杂交后代分离群体建立的甘蓝分子连锁遗传图有2个。一是胡学军等（2004）以两个不同生态型甘蓝（Brassica oleracea varcapitata）品种杂交得到的F2代为作图群体，从520个RA PD随机引物中选取111个引物对群体进行分析，建了一张含有135个标记位点，9个连锁群，覆盖基因组长度为10237cM的甘蓝分子连锁遗传图；另一个是缪体云、刘玉梅等（2007）以两个结球甘蓝高代纯合自交系624和24-5的F1代进行游离小孢子培养所获得的含有102个株系的DH永久性群体为试材，通过AFLP技术构建了结球甘蓝较高密度的分子遗传连锁图谱。该图谱包括8个连锁群，覆盖总基因组长度为6893cM含681个AFLP标记，平均图距为101cM。连锁群的大小从304cM（LG8）到2144cM（LG1），每个连锁群上的标记数目介于4个（LG6）到291个（LG1）之间，平均图距在074cM到658cM之间（表10-9）。该图谱是目前用甘蓝品种间杂交后代获得的永久性群体（DH群体构建）构建的第一张结球甘蓝分子遗传连锁图谱。

表10-9 利用结球甘蓝DH群体构建的分子连锁图谱的基本特征

注：资料引自Table1 Chcteristic of Genetic Linkage Map of Cabbage。

3重要性状的分子标记及基因定位

（1）甘蓝显性雄性不育基因分子标记 中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝课题组对国内外首次发现的甘蓝显性雄性不育基因DGMS79-399-3的分子生物学进行了较系统的研究，先后找到了与显性核雄性不育基因连锁的RAPD、RFLP、SSR、AFLP等分子标记。王晓武等（1998，2000）在甘蓝中利用BSA法筛选到与显性细胞核雄性不育基因（Ms）连锁的RAPD标记OT11900，这个标记与甘蓝显性的连锁距离为748cM，这一标记已转化成易于利用的新标记EPT11900，效果接近SCAR标记。EPT11900在辅助两个甘蓝自交系回交三代及两个青花菜自交系回交一代的Ms基因转育中，预测的准确率超过90%。刘玉梅等（2003）运用RFLP、SSR技术采用集群分析法（BSA）筛选与甘蓝显性细胞核雄性不育基因连锁的分子标记，获得了与该不育基因连锁的RFLP标记pBN11（图10-27）和SSR标记C03180（图10-28），首次将该不育基因定位于第1和第8条染色体上。经两个回交分离群体的检测，RFLP标记pBN11与甘蓝显性细胞核雄性不育基因的遗传距离为1787～5189cM，SSR标记C03180与该不育基因的遗传距离为430～894cM。其中pBN11在两个回交群体中的DNA杂交带型均呈共显性，可用于甘蓝纯合基因型的鉴定。C03180分别表现为共显性和显性，可用于部分甘蓝显性不育系统中纯合基因型的鉴定。用该标记对不同类型的甘蓝DGMS高代回交群体检测表明，该标记可准确区分部分甘蓝材料分离群体中的纯合基因型和杂合基因型。在辅助不同甘蓝类蔬菜高代回交转育群体的甘蓝DGMS基因转育中，检测的准确率达93%以上。结果表明，获得的SSR标记C03180可用于甘蓝DGMS基因在不同甘蓝类蔬菜中的辅助转育。用获得与甘蓝显性细胞核雄性不育基因连锁的SSR标记C03180分别对44份不同熟性、不同球形的结球甘蓝自交系DNA进行检测，结果表明在22份扁球型结球甘蓝自交系中，除一个自交系中有该标记外，其余均无该标记，而大多数圆球形甘蓝自交系中则均有该标记，但在所检测的所有圆球形紫甘蓝、尖球形甘蓝中则均无此标记。这一结果初步表明，获得的SSR标记可用于扁球形甘蓝、尖球形甘蓝和圆球形紫甘蓝的显性雄性不育辅助选择。

图10-27 RFLP探针/酶组合pBN11/BglⅡ在亲本和甘蓝显性雄性不育回交一代群体（301Y1-L13×8020）×8020部分单株之间的杂交结果（箭头所示为差异性片断）

M分子量标记（λDNA/HindⅢ+ФX 174 RF DNA/HaeⅢ）18020 2F1（301Y1-L13×8020）3 301Y1-L13 4～6和16～31为回交群体中的不育单株 7～15为回交群体中的可育单株

图10-28 SSR引物0113C03对甘蓝显性雄性不育397群体部分建池单株的扩增带型

M100bp Marker MS397不育池 MF397可育池 S不育单株 F可育单株 箭头所示为差异性片段

黄和艳等（2006）以甘蓝显性雄性不育系DGMS79239923与优良品系02212回交自交系为材料，利用远红外荧光标记AFLP技术及Li-cor基因测序仪对回交自交系不同基因型（MsMs、Msms和msms）材料进行AFLP连锁标记快速筛选，从512对引物组合中筛选出17个差异标记。

（2）抗病基因的分子标记 目前报道的主要有甘蓝根肿病抗性的QTL和黑腐病抗性的QTL及抗芜菁花叶病毒基因的分子标记。在黑腐病的抗性研究中，Camargo等（1995）通过甘蓝品种BI-16和抗病青花菜品种OSUCR-7杂交的F3家系，找到了与甘蓝抗黑腐病有关的多个数量基因位点。前人对于根肿病也做了不少研究，Landry等（1992）报道了与甘蓝根肿病小种2抗性基因连锁的2个RFLP标记CR2A和CR2b，这2个位点解释的变异占总变异的61%。Voorrips等（1997）通过RFLP和AFLP分析，从甘蓝双单倍体（DH）群体中找到了根肿病抗病位点pb-6和pb-42，这2个位点的加性效应可解释双亲68%的遗传变异和DH系间60%的遗传变异。

由于芜菁花叶病毒对十字花科经常造成严重威胁，因此，对抗病毒育种的研究受到了重视。王雪、刘玉梅等（2004）以中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝组的感病自交系01-16-5-7和高抗自交系20-2-5及其构建的F2代分离群体为试材。用侵染中国甘蓝的TuMV主导致病株系——TuMV-C4对亲本和F2的各个单株进行室内人工接种，利用酶联免疫吸附测定法对各植株TuMV的抗性进行鉴定。根据鉴定结果采用BSA法选取不同F2单株构建两对抗感池，应用AFLP分子标记技术找到了与甘蓝抗TuMV基因连锁的分子标记E24M61-530（图10-29），经最大似然函数计算，Kosambi函数校正，其遗传距离为1444cM。曹必好等（2002）以结球甘蓝高抗TuMV自交不亲和系84075为材料，构建了cDNA文库。对构建的cDNA文库进行筛选，得到一个阳性克隆（命名TuR2）。测序及序列分析表明，该基因与已克隆的抗病基因有不同程度的同源性，初步确定TuR2是一个与结球甘蓝抗TuMV相关的基因。

图10-29 引物组合E24M61在甘蓝F2群体部分单株上的扩增结果

S1为感病池 R1为抗病池 S感病单株 R抗病单株 S、R交换单株左边箭头所示为E24M61扩增出的差异带（530bp）

（3）与开花性状有关的QTL Kennard等（1994）利用甘蓝和青花菜的F2群体构建的RFLP连锁图，鉴定出控制甘蓝开花位点的主效基因分别位于第5和第7连锁群上，而同时还有7个相关性状的标记位点。控制从种植至现蕾天数的主效基因位于第2和第7连锁群上，同时还发现，从种植至现蕾的天数和现蕾至开花的天数两个性状的许多标记位点密切相关。Camargo和Osborn（1996）对甘蓝的开花性状进行了定位，他提出了两个指标用于评估开花时间：一年生植株比例（PF）和开花时间指数（FT）。分别找到一个QTL与PF有关，2个QTL与FT有关，3个QTL可以解释甘蓝541%开花时间的变异。陈书霞等（2003）利用芥蓝C100-12×甘蓝秋50-Y7杂交组合的F2作图群体构建的RAPD标记连锁图进行QTL定位，在9个连锁群上共定位了28个QTL位点。其中控制抽薹期的3个，分别位于连锁群LG1、LG3、LG8上，均为主效基因，解释了该性状变异的828%～853%。未检测到微效基因。LG1上的QTL位点位于标记A03-3530和A03-1375之间，对抽薹时间的控制呈现负加性—负显性效应。在LG3上的QTL位点位于标记P09-1000和标记Q01-0500之间，解释了抽薹时间变异的828%，该位点也呈现负加性—负显性效应。位于LG8连锁群上的QTL位点位于标记U16-0300和Z20-0150之间，距U16-030060cM处。联合解释了该性状变异的865%。Okazaki等（2007）用青花菜和甘蓝的F2为群体作图，定位了6个控制开花的QTL，并克隆了4个与FLC同源的基因BoFLC1、BoFLC2、BoFLC3、BoFLC5，其中BoFLC1、BoFLC3、BoFLC5和控制开花的QTLs不连锁，BoFLC2有助于开花时间的控制。

（4）自交不亲和基因 甘蓝自交不亲和基因（SSI）特性由亲本细胞中的具有多种复等位基因的单一孟德尔位点S位点所控制，根据SLG和SRK位点的多态性，现已鉴定出4个与S位点连锁的基因：Ｓ位点受体激酶（S-locus receptor kinase，SRK）基因，S位点糖蛋白（S-locus glycoprotein，SLG）基因，Ｓ位点富含半胱氨酸蛋白（S-locus cysteine rich，SCR）和Ｓ位点蛋白Ⅱ（S-locus protein Ⅱ，SPⅡ）基因。Nasrallah等（1985）就获得了甘蓝编码S-糖蛋白等位基因（SLG）cDNA克隆，并对其遗传行为进行了研究，他们以一个具有高度活性的SLG6等位基因的DNA克隆作为探针定位4个甘蓝类的分离群体的同源RFLP位点，探明了3个连锁位点。Brace等（1993）和Nishio（1997）应用PCR-RFLP的方法对甘蓝的SLG位点，Nishio（1994）对甘蓝的SPK基因分别进行了多态性分析，结果表明，两个基因均是多态性很丰富的位点。Cheung（1997）利用PCR-RFLP技术对甘蓝自交不亲和基因进行了定位。Camargo等（1997）通过对甘蓝×花椰菜分离群体内单个个体的自交不亲和性表现型分析，证实SI基因同第2连锁群上1个RFLP位点紧密连锁。

（5）形态性状分子标记 有关甘蓝的园艺性状的QTL研究较少。Kennard等（1994）对一个由甘蓝和青花菜构建的F2群体的园艺性状的分析表明，茎部性状集中分布在3c、8c上；叶片性状集中分布于4c、5c上，他们还发现，一些控制同一性状的不同QTL位点分布与不同连锁群重复的RFLP标记分布具有平行关系。Lan（2000）等对甘蓝的结球性状的数量位点进行了比较作图分析，发现8个位点与甘蓝的结球性状有关。此外，还有对下胚轴的有无，根的伸展性，以及叶毛等性状进行了标记。Sebastian等（2002）利用花椰菜和抱子甘蓝的DH群体构建遗传图谱，在9个连锁群上检测到控制叶宽的QTL有4个，分别位于连锁群LG6、LG7和LG8上，控制叶柄长的3个QTL分别位于LG3、LG6和LG7，控制叶耳长的1个QTL位于LG1上，控制中肋宽的1个QTL位于LG2上。胡学军（2004）利用已构建的甘蓝连锁图谱对甘蓝叶球紧实度和中心柱长进行了QTL定位分析，检测到3个与叶球紧实度相关的QTL，总贡献率为591%。缪体云、刘玉梅等（2007）应用AFLP标记技术，用软件Map QTL 40和多QTL模型法对甘蓝25个主要园艺性状进行QTL定位和遗传效应分析，共检测到了11个与主要园艺性状相关的QTL，分布于6个连锁群上。其中控制开展度、最大外叶长、外叶形状、株型、最大外叶柄长和外叶叶脉6个与叶片相关的性状的QTL各1个，其贡献率分别为103%、99%、98%、93%、87%和86%；控制叶球形状、叶球质地、外短缩茎长、叶球内颜色和叶球高这5个与叶球相关的性状的QTL各1个，其贡献率分别为119%、88%、92%、99%和84%。

（二）基因组学研究

植物的生长和发育是一个有机体或有机体的一部分的形态建成和功能按一定次序进行的一系列生化代谢反应的总和。植物功能基因组研究就是要利用植物全基因组序列的信息，通过发展和应用系统基因组水平的实验方法来研究和鉴别基因组序列的作用；研究基因组的结构、组织与细胞功能、植物进化的关系以及基因与基因间的调控关系；从表达时间、表达部位和表达水平3个方面对目的基因在植物中的精细调控进行系统研究等。

在甘蓝的基因组学研究中，娄平等（2003）利用cDNA-AFLP技术，比较分析了通过转育获得的甘蓝显性核基因雄性不育材料23202和青花菜雄性不育材料，与其对应可育亲本植株在花蕾发育过程中基因表达的差异。获得11条与显性核不育基因相关的序列。利用NCBI和拟南芥在线数据库对获得的与显性核不育相关的11条序列进行同源性分析，其中7条序列与已知基因具有较高的同源性，4条未检索到显著同源性。在同源性较高的7条序列中，初步分成与细胞壁合成有关的基因及在花粉发育过程中特异表达的基因两大类。并对获得的显性核不育相关序列MS1615300和MS1916128进行了RT-PCR验证，结果表明，两显性核不育相关序列在RT-PCR和cDNA-AFLP表达图谱中具有相同的表现模式，即MS1615300为育性特异性片段而MS1916128通过不同循环数RT-PCR分析表现出量的差异。利用生物信息学手段，结合细胞学观察及相关文献，对获得的与雄性不育相关基因进行功能注释，结果表明：MS1124110序列与果胶甲酯酶基因同源，其主要功能与小孢子发育中胼胝体的正常分解有关；MS1620200序列与果胶裂解酶基因同源，其主要功能与小孢子发育过程小孢子细胞壁的粘连有关；它们共同参与调控小孢子的正常发育，并在此基础上提出了甘蓝显性核不育发生的可能模式及MS1124110序列与MS1620200序列在花粉败育中的作用。对其他具有同源性的序列的分析表明，MS1615300与硫氧环蛋白类基因同源，硫氧环蛋白与花粉外壳蛋白及S位点识别蛋白有关；MS1620200为与快速碱化因子同源，属于信号肽类保守多肽，在植物蛋白信号跨膜传导方面起重要作用；MS1324200则与雄性不育有关的花粉特异性脯氨酸富足蛋白APG前体具有较高同源性；MS1620200与胚胎晚期发育蛋白具有高度同源性；MS1224200与大白菜花蕾中一个特异表达cDNA一致性达100%，目前关于此片段的功能尚未知晓，可能是在芸薹属内与显性核不育有关的一个新基因。

康俊根等（2006）通过cDNA-AFLP技术分别对黑芥胞质不育（NiCMS），隐性核不育（RGMS），萝卜胞质不育（OguCMS）和显性核不育（DGMS）4种甘蓝雄性不育类型和遗传背景一致的可育材料进行分析，研究了4种不育类型育性相关基因的时序表达特征。结果表明大部分（6725%）雄性育性相关基因的表达具有典型的顺序发育特征，在花药发育过程中，多数基因表现为以线性模型在不同时期顺序表达。而E、F、G、H和I等5种表达模式为不符合顺序表达模式的育性相关基因，推测可能是各种孢子体组织独立或与小孢子协调表达的旁路基因。进一步对代表不同类型的23条TDFs（TDFs transcript derived fragments转录差异片段）测序表明，其中167%基因参与细胞壁水解酶功能。芯片试验的结果表明，这4种雄性不育类型败育的根本原因都是由于绒毡层的异常干扰了小孢子的正常发育。对胞质不育类型特异下调的3种重叠关系的基因功能分析发现，NiCMS对细胞质内各种细胞器相关基因的干扰比OguCMS要高，两种胞质不育类型线粒体功能异常对甘蓝发育影响的分子机制近似于对生理刺激或环境胁迫的应激反应功能的下降或丧失。同时筛选出89个药壁组织中特异表达的基因（主要是绒毡层特异表达的基因）。进一步比较药壁组织特异表达的功能基因和花粉特异表达的功能基因，发现药壁组织中转录因子比例较高而激酶类基因比例则较低。

赵永斌等（2006）采用PCR、RT-PCR以及其他分子生物学方法，以甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对MLPK基因进行扩增克隆，首次得

并没有。

每种生物都有属于其本身的自然规律，就像恐龙能够存活几万年。石油是经过数亿年的积淀而形成的那么人类的寿命只有区区百年，或许百年之内音生老病死各种原因而去世的人们更多。又凭什么说人类的寿命已经超出了自然规律了呢？

石油开采

只是随着现代医疗设备的进步与发展，我们能够挽救一些人的生命。在以前，科技和医疗设备都不大发达的时代，一种小小的疾病可能就结束人们的生命。

医疗设备

而现在我们的技术逐渐成熟。一些疾病，可以通过治疗，从而痊愈，甚至帮我们来延长寿命。动格更加合理的饮食方式来改善自己的生活习惯。从而达到延年益寿的状态，使我们的生活作息更加科学！但这并不能说明人类的寿命已经超出了自然规律而是说明了科技的进步和医疗设备的完善可以使我们获得更长寿的生命。

生活习惯

办理POS机第一个问题就是：不到账找谁？

1、银行办理的不用说，找银行；

2、外面办理的就要注意点了，不到账找谁，找办理的业务员或者代理的公司都是扯淡，剁了他们都没这么多钱，一定要明确是哪个结构发给你POS机的，有支付牌照的公司就放心使用。比如你中汇的机器就联系中汇客服电话，乐富就联系乐富的。

注意的陷阱：目前有些公司没有牌照，但也发放POS机，或者暂时还没拿到牌照，都要小心

GRCH37，b37和hs37d5： 可以将hs37d5理解为b37的升级版，b37为GRCH37的升级版。b37在GRCH37的基础上进行命名和坐标系统规范，包括线粒体和GL开头的一些没有定位到基因组的序列；

hs37d5在b37基础上增加了一条病毒序列（疱疹病毒），一条decoy序列（hs37d5，来自BAC或者质粒克隆等，没有具体的变异检测的作用，但是能增加比对率，以及提升正确的比对率），并且在Y染色体上把X,Y染色体的同源区mark 成了N。

hg19与hs37d5的坐标系统一样，1-X,Y染色体碱基信息一模一样。线粒体有差别（版本不一样，hs37d5用的是修正版的NC_012920，而hg19是老版NC_001807），建议使用NC_012920（也有基于hg19更新线粒体信息的hg19基因组）。

扩展资料：

GSDB数据库中条目的格式与GenBank中的基本一致，主要区别是GSDB数据库中增加了GSDBID识别符。GSDB数据库可以通过万维网查询，也可以使用服务器-客户机关系数据库方式查询。无论用哪种方法，熟悉数据库结构化查询语言SQL，对更好地使用GSDB数据库会有所帮助。

该数据库采用服务器-客户机关系数据库模式，大规模测序机构可以通过计算机网络向服务器提交数据，并在发送之前对数据进行检查，以确保数据的质量。

参考资料来源：百度百科-基因组序列

百度文库搜索质粒构建和引物设计即可，很详细。

引物设计的原则

引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避 免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即 错配)。

具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性 (internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的 GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：

1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延 伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。

2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导 致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增 加[2]。

3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配 位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。

4 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。

5 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest

neighbor method) [6][7]。

6 ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。

7 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过45kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。

8 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载 体的相应序列而确定。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC

2

含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR 因为产 物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条 件。

引物的自动搜索和评价分析

软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数 商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在 这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以 “Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“ector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。

要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件 的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo” 进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。

Primer Premier 50 的使用技巧简介

1 功能

“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、

限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源

性分析功能（ ），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中

最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、

语音提示键盘输入（ ）等等。

有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见 结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会 遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结 构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒 体（Inertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（ertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。

2 使用步骤及技巧

“Premier”软件启动界面如下：

其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功 能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列 等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新 限制性内切酶或基元。

进行引物设计时，点击按钮，界面如下：

进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目

的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）

等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然 后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按， 这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物 (Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分 为100，即各指标基本都能达标（如下图）。

点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”

主窗口，如图所示：

该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些

5 性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引 发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引

物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的

窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最 好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。

在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。

如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规

则，反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。

总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易

使用，是一个相当不错的软件。

Oligo 622 使用技巧简介

1 功能

在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容

易被其复杂的图表吓倒。Oligo 50 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 22 的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。

2 使用（以Oligo 622 为例）

Oligo 622 的启动界面如下：

图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是622 版本的新功能，为邻近6

至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发6的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 50，只是显示更清楚了。

经过Windows/Tili 项后的显示如图：

在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左 下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选 取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。∆G 值反映了序列与模板的结

合强度，最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）

Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线 为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。

当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或 下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值 越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；

与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过45 为好。 当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构， 而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹 结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游 引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基 因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较 高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的7

8

模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的 引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。

当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键d出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位

置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。

由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并

不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求

去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。

一型内含子更普遍，存在于低等真核生物中，比如四膜虫，多头黏菌，真菌线粒体中很常见

二型内含子多存于线粒体

一二型内含子的剪接都是自我剪接

一型需要一个游离的G-OH提供起始

G-OH进攻内含子五端，得到内含子五端的磷酸，外显子的3‘羟基就空出来了，他去攻击下一个外显子，两个外显子一连，内含子就剪下来了

二型需要从自身序列得到用于起始的羟基，之后形成套索结构

可以从剪接方式不同来判断

还有，有些内含子可以编码转座酶（内含子之所以是内含，因为在他所在的基因不编码序列，但他可以自己编码序列，比如在一个代谢酶基因内的内含子，他的序列不编码代谢酶的一部分，但是编码一个转座酶）

内含子可以转座的

但是呢，两种内含子转座方式不同，一型采用dna介导的，也就是直接移一段dna转座

二型用rna介导的，也就是反转录机制转座

你还可以根据二级结构观察

一型有九个螺旋结构，二型是几个茎环

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