rNTP是什么

RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。RNA干扰（RNA interference）的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化/替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。有人推测：小分子RNA可能代表发现了一个新层次上的基因表达调控方式。生物通早在去年底到今年初已经有很多文章介绍有关siRNAs以及其在RNA干扰中的作用以及研究应用方法，在这里生物通继续为我们的用户介绍另一种越来越引人注目的小分子RNA——microRNA。

什么是miRNA

MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。

miRNA 的特征

已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21—25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。

最近3个研究小组分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定的100个新miRNAs中，有15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组具有高度的保守性（只有有1—2个碱基的区别），Lau 和Bartel 实验室的同事更加认为：所有的miRNAs可能在其他物种中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物体中行使同一功能的基因群就可比作为一个门类，这些类似的基因被称为“直向同源物”）。

Bantam 最早被认为是果蝇中参与细胞增殖的一个基因位点。已知几个包含增强子的转座子插入跨越这个位点的一段123kb区域会导致果蝇的眼和翅重复生长，而由转座子介导的一段跨越该位点的23kb片断缺失则导致突变果蝇个体小于野生型果蝇。Cohen和同事用一段385kb的片断导入21kb片断缺失的果蝇中使其恢复原来的大小。但是奇怪的是表达这个385kb片断中的EST却没有同样的效果。Cohen将这个片断和疟蚊Anopheles gambiae的同源序列进行比较，发现一段90bp的高度保守区，经过RNA folding program (mfold)发现这个保守序列可以形成发夹结构，使得这个区段很象是一个miRNA的前体。这个结果经过Northern blot证实突变果蝇的幼体缺少一个21bp的bantam miRNA ，用这个90bp的mRNA前体经过一系列的“功能缺失”—“功能恢复”实验，证实 bantam miRNA在细胞增殖中的作用。研究人员用计算机程序检索在hid mRNA的3’非编码区找到了bantam的3个潜在的结合位点（ hid是果蝇中一个诱导凋亡的基因），并证实 bantam miRNA抑制hid 的翻译而非转录。

miRNAs的表达方式各不相同。部分线虫和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达，而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异。

miRNA的功能

对microRNAs (miRNAs)的研究正在不断增加，原因是科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNAs中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子，因而具有重要意义。

第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编码区(3’UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译从而调控线虫发育进程(reviewed in Pasquinelli 2002)。

bantam miRNA是第一个被发现有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知还有一些miRNAs可能参与在细胞分化和组织发育过程中起重要作用的基因的转录后调控，例如mir-14、mir-23 等。

在植物miRNAs的研究中有两条线索提示miRNAs可能参与植物的发育过程。一是在carpel factory (car) 突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。CARPEL FACTORY 是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育。

对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育(Reinhart 2000)，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡(Brennecke 2003），脂肪代谢（Xu 2003)和细胞分化(Kawasaki 2003)。此外，一个研究表明，2个miRNAs水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关，提示miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系(Calin 2002)。

由于miRNAs存在的广泛性和多样性，提示miRNAs可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对miRNA的研究还处于初级阶段，据推测miRNAs在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是：miRNAs可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。

然而，大多数miRNAs的功能仍然是个谜。

miRNA的作用方式

最早被发现的两个miRNAs——lin-4 and let-7被认为是通过不完全互补结合到目标靶mRNA 3’非编码区端，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，阻断mRNA的翻译。多个果蝇miRNAs也被发现和他们的目标靶mRNAs的3’非编码区有部分同源。由于miRNAs和其潜在的目标靶之间并非完全互补，这使得通过信息学的方法鉴定miRNA的目标靶位点变得困难。因而也无法确定miRNAs的作用方式是什么，以何种机制影响mRNA的翻译，以何种方式调控基因表达。miRNAs的作用目标靶和活性机制一直是各地的研究人员的关注热点。

在植物中目前有一个miRNA和3个潜在的目标靶基因完全互补（这些scarecrow 基因编码潜在的转录因子），尽管目前还不清楚这些基因是否就是miRNA的目标靶，这仍是第一次发现miRNA 和其潜在的目标靶完全互补，也提示miRNA可能包含和siRNA类似的作用方式。

识别 miRNAs的方法

多个研究小组采用生物化学结合是生物信息学的方法开展对miRNAs的研究工作。由于据推测都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23个碱基大小、有5’端磷酸基和3’羟基的RNA片断，有的实验室采用改良的定向克隆方法来筛选具有相同特征的小分子——筛选一定大小的RNA分子，连接到3’和5’的适配子（adapters），逆转录并通过PCR扩增、亚克隆并测序。miRNA前体在基因组上的定位和聚类是通过向基因组数据库查询进行。这个方法有助于判断miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解产物。

有的实验室通过一种RNA folding program ’mfold’ 来判断C elegans 和C briggsae 之间的高度保守区域是否含有潜在的miRNA前体，然后用Northern Blots的方法来确定这些miRNAs是否真的表达了。

尽管有数百个miRNAs通过生化或者是生物信息学的方法被鉴别出来，已经鉴别出来的miRNAs只不过是沧海一粟，由于很多已经鉴别出来的miRNAs是从单个克隆中鉴别出来的，所以可以假设还有很多miRNAs在分离和鉴定过程中被“漏掉”了，测序工作还远远不够。

miRNA和siRNA的关系

miRNA和siRNA之间的关系令人迷惑。从表面上说，一个是非编码的单链小分子RNA，在进化上高度保守，通过翻译抑制调控基因表达而不影响转录本的稳定性；另一个是针对编码区的双链小分子RNA，每个转录本都可能有很多个siRNAs，是通过降解目标靶，在转录后调控基因表达。由于每个mRNA模版可能产生很多个siRNAs，要给每个siRNA定一个基因的名字就很困难。miRNA是进化进程中高度保守的，因此给直向同源物一个同样的名字可能有助于了解他们的功能，而给另一个物种中一段无关的序列一个同样的名字就容易造成混乱。

然而，据推测miRNAs通常是由较大的（70­90 nt）的茎环结构（发夹结构）前体经Dicer酶切割得到的，而Dicer同样负责将长双链RNA切割为siRNA，而且二者的长度也差不多，同样有调控基因表达功能。因而这两类小分子RNA之间的关系格外令人关注。

两个广为人知的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编码区(3’UTRs)，通过一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制从而抑制蛋白质合成。这种结合并不诱导mRNA靶的降解，就是说作为翻译抑制子本身不影响对应mRNA的丰度，其原因据推测是由于miRNA和结合位点之间不完全互补。这就区别于siRNA的介导的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以类似siRNA的方式介导目的RNA的降解。实验表明引入和let-7目的mRNA靶完全互补的miRNA会诱导mRNA靶的降解。还有实验结果表明一些miRNA，包括在植物中发现的Scarecrow miRNA，能结合完全互补的mRNA链从而降解mRNA序列，抑制蛋白合成。这提示miRNAs可以和siRNAs一样作用，这两种小分子RNA作用通路可能有重叠的部分。这种重叠同样提示siRNAs可能也有和miRNAs同样的功能。

一个很有趣的实验证实这个观点：Doench和同事挑选一个已知在体内可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA，然后在荧光素酶报告基因的3’端插入对应的CXCR4结合位点——其中一个拷贝是插入一个完全匹配的CXCR4结合位点，另一个拷贝插入4个只有3’和5’端匹配，而中间不同的CXCR4结合位点，这样选定的siRNA就不能完全结合到这个结合位点——中间形成一个突起的不匹配的环。将这两个拷贝转入Hela细胞并用siRNA诱导基因沉默。结果很有趣——两个实验都录得荧光素酶活性下降了超过10倍，RT-PCR和Northern分析证实，第一个实验的荧光素酶转录本下降了超过10倍，这正是正常的siRNA介导的RNAi反应，目标靶mRNA降解导致表达水平的下降，而第二个实验中荧光素酶转录本仅仅下降12倍，这种目的基因表达水平下看起来象源于miRNA介导的翻译抑制降，而不是siRNA介导的影响mRNA的稳定性导致。实验表明：siRNA可能以miRNA的方式作用于mRNA。实验人员还进行了另一个实验：改变第二个实验中的不匹配环的碱基序列看起来不影响抑制效果，但是siRNA和报告基因上的结合位点的匹配程度越高抑制效果越好，增加siRNA的量，抑制效果越好——这一点和siRNA抑制的情况一样——唯一不同的是：完全匹配的结合位点（siRNA作用方式）可以单独起作用而相互不影响，而增加不完全配对的结合位点（注意在第二个实验中用了4个CXCR4结合位点）的个数对翻译抑制有显著的加乘作用。

在哺乳动物细胞中还没有找到内源的siRNA，外源的siRNA介导的RNAi作用正是一种抵御机制。而miRNAs则广泛存在于哺乳动物细胞中，从理论上推测可能参与多种调控作用。这两种小东西的作用机制和相互关系的本质就显得更加扑朔迷离。如何在实验中正确鉴定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成为一个值得关注的问题。

未来要解决的问题

miRNAs在多个物种中广泛被发现，而且在进化上高度保守。这些“小玩意儿”留给我们一大堆谜团：miRNA的确切功能是什么？它的目标靶是什么？作用机制是什么？也许需要对植物或者线虫的基因组进行miRNAs突变株的筛选，在果蝇中可以用targeted-disruption缺失miRNA序列。对miRNA突变株伴随的表型缺失进行研究，有助于解释miRNAs的功能。

正如Phillip Zamore说的：“如果miRNAs在进化的进程中如此高度保守而没有任何实际功能，那真是大自然拿科研人员开涮——而且是一个残酷的玩笑”。

研究miRNA的新工具

随着小分子RNA日益收受到研究人员的重视，很多研究小分子RNA的新方法不断推出。

小分子RNA的分离

由于小分子RNA可能参与分化、发育、组织生长、脂肪代谢等生理过程，在不同的组织和发育阶段的表达水平有所不同，进一步了解小分子RNA的生物功能需要确定其在各种生物样品中的表达水平，因而需要一种精确的定量纯化方法，从而得到可信的数据。

现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA（200nt以上），小分子RNA往往被淘汰掉，因而不适用于小分子RNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留小分子RNA，但是后继的沉淀步骤比较费时费力。mirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纤维滤膜离心柱(glass fiber filter，GFF)，既能够有效富集10mer以上的RNA分子，又能够兼备离心柱快速离心纯化的优点，是一个不错的选择。对于特别稀有的分子，由于需要分离大量RNA而导致高背景而降低灵敏度，还可以进一步富集10mer到200bp的小分子RNA来提高灵敏度。

小分子RNA探针的制备

方法其实很简单：只需要准备目的基因的一小段寡核苷酸序列，3’端另外增加8个和T7启动子互补的碱基，将这段寡核苷酸和T7启动子引物退火，用Klenow大片断补齐得到双链的转录模版，然后用T7 RNA聚合酶、rNTP和标记物混合，体外转录得到标记的小分子RNA探针。这种方法可以快速制备各种标记（同位素、非放射性标记均可）的小于100nt的小分子RNA探针，适用于包括RPAs，Northerns 和原位杂交等各种方法检测小分子核仁RNA( small nuclear RNA,snRNA)，small interfering RNA (siRNA),，micro RNA (miRNA)和 mRNA。非放射性标记的探针还可以用于原位杂交研究miRNA或者mRNA在组织中的分布。

小分子RNA的检测

由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究非常困难，目前多数研究人员采用Northern Blots——一种技术复杂而费力的方法来检测小分子RNA的存在。传统的Northern Blot的方法是是用探针检测固相支持物（膜）上的目标分子，由于用探针检测液相中的目标分子远比检测固相中的目标更为灵敏，生物通在这里为大家推荐一种基于核酶保护分析方法改进的新方法——将同位素标记好的小分子RNA探针和待检测样品混合杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并纯化杂交的RNA分子，最后通过变性胶电泳放射自显影检测结果。这个基于液相杂交的新方法不但 *** 作简单而快速，而且灵敏度极高——可以半定量检测少至10ng总RNA模版中的小分子RNA，或者说，可以检测attomole (10-18 mol)级别的靶目标！灵敏度是Northern Blot的100倍。除此之外，研究人员还可以在同一个样品中同时检测多个小分子RNA和长的RNA模版。应该说，这个灵活巧妙的设计可以为从事小分子RNA实验的研究人员带来不少方便。

总而言之，无论是siRNA, miRNA, snRNA还是其他的小东西，小分子RNA研究的不断深入将帮助我们揭示更多生命的奥秘。

有谁会想到，一种红眼、双翅、羽状触角芒、身体分节、黄褐色的小昆虫，在近百年间竟然能够“培养”出好几位获得诺贝尔奖的大科学家。它就是果蝇。果蝇英文俗名fruitfly或vinegarfly，果蝇广泛地存在于全球温带及热带气候区，而且由于其主食为腐烂的水果，因此在人类的栖息地内如果园，菜市场等地区内皆可见其踪迹。除了南北极外，至少有1000个以上的果蝇物种被发现，大部分的物种以腐烂的水果或植物体为食，少部分则只取用真菌，树液或花粉为其食物。

在不供给食物的情况下，果蝇可存活50小时左右，在不供给水的情况下，果蝇无法活过一天。蛹期果蝇在其正常5天生活周期下可取食其体重3~5倍之食物，雌果蝇在产卵期每日可取用与其体重等重之食物。果蝇成虫的食物内需有醣类，而蛹期果蝇则可只依赖酵母即可生育。

以果蝇作为遗传学研究的材料，利用突变株研究基因和性状之间的关系已近一百年，至今，各种研究遗传学的工具已达完善的地步，果蝇提供我们对今日的遗传学的知识有其不可磨灭的贡献；从1980年初，DrsCNesslein-Volhard和EWeichaus以果蝇作为发育生物学的模式动物，利用其完备的遗传研究工具来探讨基因是如何调控动物体胚胎的发育，也带动了其它模式生物（线虫、斑马鱼、小鼠和拟南芥等）的研究，且成果非常多。

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)是双翅目昆虫，生活史短，易饲养，繁殖快，染色体少，突变型多，个体小，是一种很好的遗传学实验材料，是一种模式生物。基因组全长kb，大约编码13600个基因。

黑腹果蝇是一种原产于热带或亚热带的蝇种。它和人类一样分布于全世界，并且在人类的居室内过冬。雌性体长25毫米,雄性较之还要小。雄性有深色后肢，可以此来与雌性作区别。

雌蝇可以一次产下400个05毫米大小的卵，它们有绒毛膜和一层卵黄膜包被。其发育速度受环境温度影响。在25℃环境下，22小时后幼虫就会破壳而出,并且立刻觅食。因为母体会将它们放在腐烂的水果上或其他发酵的有机物上，所以它们的首要食物来源是使水果腐烂的微生物，如酵母和细菌，其次是含糖的水果。幼虫24小时后就会第一次蜕皮，并且不断生长，以到达第二幼体发育期。经过三个幼虫发育阶段和四天的蛹期，在25℃下过一天，就会发育为成虫。

在20世纪生命科学发展的历史长河中，果蝇扮演了十分重要的角色，是十分活跃的模型生物。遗传学的研究、发育的基因调控的研究、各类神经疾病的研究、帕金森氏病、老年痴呆症、药物成瘾和酒精中毒、衰老与长寿、学习记忆与某些认知行为的研究等都有果蝇的“身影”。

果蝇以发酵烂水果上的酵母为食，广泛分布于世界各温带地区。果蝇具有生活周期短、容易饲养、繁殖力强、染色体数目少而易于观察等特点，因而是遗传学研究的最佳材料。早在1908年由天才的遗传学家摩尔根把它带上了遗传学研究的历史舞台，约在此后30年的时间中，果蝇成为经典遗传学的“主角”。

科学家不仅用果蝇证实了孟德尔定律，而且发现了果蝇白眼突变的性连锁遗传，提出了基因在染色体上直线排列以及连锁交换定律。摩尔根1933年因此被授予诺贝尔奖。1946年，摩尔根的学生，被誉为“果蝇的突变大师”的米勒，证明X射线能使果蝇的突变率提高150倍，因而成为诺贝尔奖获得者。

在近代发育生物学研究领域中，果蝇的发生遗传学独领风骚。1995年，诺贝尔奖再次授予三位在果蝇研究中辛勤耕耘的科学家。果蝇为进一步阐明基因－神经（脑）－行为之间关系的研究提供了理想的动物模型。

专家认为，近一个世纪以来，果蝇遗传学在各个层次的研究中积累了十分丰富的资料。人们对它的遗传背景有着比其他生物更全面更深入的了解。作为经典的模式生物，果蝇在21世纪的遗传学研究中将发挥更加巨大而不可替代的作用。 大肠埃希氏菌(Ecoli)通常称为大肠杆菌，是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(E．IIEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。

大肠杆菌电子显微镜下图像

大肠杆菌0157：H7血清型属肠出血性大肠杆菌，自1982年在美国首先发现以来，包括我国等许多国家都有报道，且日见增加。日本自80年代以来因食物污染该菌导致的数起大暴发，格外引人注目。在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中，截止2013年它已排在第二和第三位。大肠杆菌0157：H7引起肠出血性腹泻，约2%～7%的病人会发展成溶血性尿毒综合症，儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危急生命。

大肠杆菌（Escherichiacoli，Ecoli）革兰氏阴性短杆菌，大小05×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。莱德伯格（Lederberg）采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验，奠定了研究细菌接合方法学上的基础，以及基因工程的研究。

大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。它侵入人体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。

大肠细菌（Ecoli）为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称病致病大肠杆菌。

该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。 斑马鱼属鲤科短担尼鱼属，原产于南亚，是一种常见的热带鱼。斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对水质要求不高。孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求在25-31℃之间。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关的资料可供查询和下载，方便了研究。斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可做为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力 斑马鱼（Daniorerio,俗称zebrafish）具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖等诸多特点，特别是可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选。这些特点使其成为功能基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一。在国际上，斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入到生命体的多种系统（例如，神经系统、免疫系统、心血管系统、生殖系统等）的发育、功能和疾病（例如，神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等）的研究中，并已应用于小分子化合物的大规模新药筛选。我国开展斑马鱼相关的研究无论在规模还是在重视程度上都远远落后于国际形势发展的需要。推动和发展斑马鱼模式生物在我国生命科学研究中的广泛使用是本中心的宗旨。在国家科技部重大科学研究计划的支持下，我们汇集优势，整合我国现有的斑马鱼主要研究力量，在未来几年内逐步建立全国共享的斑马鱼模式动物研究技术和资源库，向国内同行提供斑马鱼资源、信息和技术支撑。本着提高服务效率和质量为原则，我们在上海和北京分别建立国家斑马鱼模式动物南方中心和北方中心。南方中心依托于中国科学院上海生命科学研究院，北方中心依托于北京大学和清华大学。两个中心本着优势互补的原则，共同开发研究技术和资源，以辐射状向国内研究人员提供服务，积极推进我国斑马鱼相关科学研究。

斑马鱼的发育谱系

主要技术和资源服务内容：

1)斑马鱼基因表达分析服务：包括抽提斑马鱼基因组DNA和总RNA，核酸原位杂交探针制备和纯化，全胚胎原位杂交技术，显微注射技术，基因过表达（over-expression）和基因下调（morpholinoknockdown）技术；

2)斑马鱼转基因技术服务：包括各类斑马鱼非特异性和组织特异性启动子的克隆，基因组BAC文库筛选与修饰，基于Tol2转座子的转基因质粒的构建，以及子一代转基因系的筛选和保存；

3)斑马鱼基因功能活体检测服务：包括清醒斑马鱼在体共聚焦/双光子显微镜成像技术和在体电生理记录技术；

4)动物行为范式分析服务：包括感觉相关的应激行为、视觉运动行为、学习记忆行为和药物成瘾行为等；

5)斑马鱼基因突变技术服务：包括插入诱变和ENU化学诱变技术；

6)斑马鱼转基因资源库和突变体资源库服务：包括研制、收集和分发各种斑马鱼转基因品系和突变体；

7)信息服务：包括建立斑马鱼资源信息网络数据库和提供斑马鱼基因组生物信息学分析服务。

转基因斑马鱼的制备主要采用两种方法：通过Tol2转座子构建组织特异性表达报告基因的方法；利用特定基因的启动子/增强子驱动报告基因在特定细胞组织中表达的方法。

首先构建以Tol2转座子为基础的enhancertrap载体，报告基因选用GFP或RFP，最小启动子来自斑马鱼gata2基因；将上述载体与体外转录得到的Tol2转座酶的mRNA共同注射到斑马鱼的单细胞受精卵中，受精卵长大后成为founder；Founder外交（out-cross）得到F1代胚胎，从中挑选出对于报告基因具有组织特异性表达模式的胚胎，拍照记录后分类培养；F1长大后通过linker-mediatedPCR的方法鉴定对应于GFP（或RFP）表达图式的Tol2插入位点，并通过与已知基因组数据比较,对插入位点进行定位与分析；通过外交纯化得到转基因鱼，直至得到只含有单个插入品系的转基因鱼。通过克隆特定基因的启动子/增强子或BAC修饰法构建在特定组织器官或特定胚胎发育阶段表达报告基因的转基因品系。BAC方法如下：在斑马鱼基因组计划网站上通过BLAST将感兴趣的基因定位到已知的contig上，并通过contig信息寻找包含所选基因的BACID号；通过同源重组的方法对上述BAC克隆进行修饰，将报告基因引入原有的BAC克隆；将修饰过的BAC克隆通过显微注射的方法引入斑马鱼受精卵，连续观察并挑选具有特异表达模式的转基因鱼；将上述成鱼外交得到F1代，在F1代中筛选具有特异表达模式的成鱼，即得到所需的转基因品系。 在分类学上，小鼠属于哺乳纲（Mammalia）、啮齿目（Rodentia）、鼠科（Muridae）、小鼠属（Mus）动物。小鼠是由小家鼠演变而来。它广泛分布于世界各地，经长期人工饲养选择培育，已育成1000多近交系和独立的远交群。早在17世纪就有人用小鼠做实验，现已成为使用量最大、研究最详尽的哺乳类实验动物。

1．小鼠属于脊椎动物门，哺乳纲小鼠啮齿目，鼠科，小鼠属动物。

小鼠（清洁级）

2．成熟早，繁殖力强。小鼠6～7周龄时性成熟，雌性35～50日龄，雄性45～60日龄；体成熟雌性为65～75日龄，雄性为70～80日龄；性周期为4～5天，妊娠期为19～21天；哺乳期为20～22天；特别有产后发情（PostPartumOestrus）便于繁殖的特点，一次排卵10～23个（视品种而定），每胎产仔数为8～15头，一年产仔胎数6～10胎，属全年、多发情性动物，繁殖率很高，生育期为一年。

3．体形小，易于饲养管理。小鼠是啮齿目实验动物中较小型的动物，一只小鼠出生时15克左右，哺乳一月后可达12～15克，哺乳、饲养15～2月即可达20克以上，可供实验需要，在短时间内可提供大量的实验动物。饲料消耗量少，一只成年小鼠的食料量为4～8克/天，饮水量4～7毫升/天，排粪量14～28克/天，排尿量1～3毫升/天，需要的饲养条件也较简单，因个体小，可节省饲养场地。

4．性情温顺，胆小怕惊。小鼠经长期的培育，在用于实验研究时，性情温顺，易于抓捕，不会主动咬人，但在雌鼠哺乳期间或雄鼠打架时“捉弄”则会咬人，一般很少相互斗架， *** 作起来很方便，是理想的实验动物。小鼠在罐、盒内饲养时，是很温顺的，但让其到罐外，很快就恢复到处乱窜的野性。雌鼠吃食仔鼠与其胆小怕惊有关。

5．对外来刺激极为敏感。对于多种毒素和病原体具有易感性，反应极为灵敏，如百万分之一的破伤风毒素能使小鼠死亡，这是其他实验动物所不能比拟的。对致癌物质也很敏感，自发性肿瘤多。

6．便于提供同胎和不同品系动物。可根据实验要求选择不同品系或同胎小鼠做实验，也可选择同一品种（或品系）、同年龄、同体重、同性别的小鼠做实验，由于动物遗传均一，个体差异小，实验结果精确可靠。

7．喜居于光线暗的安静环境，习于昼状夜动，喜欢啃咬。小鼠白天活动较少，夜间却十分活跃，互相追逐配种，忙于觅食饮水，为此夜间应备有饲料和饮水。

8．体小娇嫩，不耐饥饿，不耐冷热，对环境的适应性差。对疾病的抵抗力也差，因而遇到传染病时往往会发生成群死亡。如果饲料中断和饮水中断会发生休克，恢复后对体质会带来严重损害。特别怕热，一出汗就易得病死亡，如果饲料温度32℃时，常会造成小鼠死亡。

9．成雌鼠在动情周期不同级段，阴道粘膜可发生典型变化，根据阴道涂片的细胞学改变，可以推断卵巢功能的周期性变化。成年雌鼠交配后10～12小时阴道口有白色的阴道栓，这是受孕的标志，小鼠较为明显、大鼠和豚鼠不明显。小鼠的动情期往往开始于晚间，最普遍的是在晚10点到晨1点，偶尔在早晨1～7点，很少在白天，大鼠也类似，但较小鼠稍早，一般在下午4～10点。

10．小鼠面部尖突，嘴脸前部有长长的触须，耳耸立呈半圆形，眼大鲜红，生有较长的尾，尾部有模列并覆有环状角质的小表皮鳞，其数量小于200片。

11．小鼠发育成熟时体长小于155cm，体重雌性为18～40克，雄性为20～49克，双子宫型，胸部有3对乳头，鼠蹊部有2对乳头，有胆囊，胃容量小，肠内能合成维生素C，小鼠的染色体为20对，寿命2～3年。

12．小鼠的体温38（37～39）℃，呼吸频率163（84～230）次/分，心跳频率625（470～780）次/分，耗氧量1530mm2/g活体重，通气量24（11～36）ml/分，潮气量015(009～023)ml，收缩压113（95～125）mmHg、舒张压81（67～90）mmHg，红细胞总数93（77～125）百万/mm3，血红蛋白148(10～19)g/100ml，白细胞总数80(6～12)千/mm3，总蛋白48(42～55)g%。

13．小鼠有多种手色，不能都叫小白鼠，一般通称为小鼠。小鼠手色有白色（albino），鼠灰色（ayouti）、黑色（black）、棕色（brown）、**（yellow）、巧克力色（chocolate）、肉桂色（cinnamon）、淡色（dilution）、白斑（piebeld）等。 英语名称：yeast

酵母菌是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。截止2012年为止已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”。截止2012年为止已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌主要的生长环境是潮湿或液态环境，有些酵母菌也会生存在生物体内。

酿酒酵母的扫描电镜照片

酵母营专性或兼性好氧生活，如今未知专性厌氧的酵母。在缺乏氧气时，发酵型的酵母通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇来获取能量。

C6H12O6(葡萄糖)→2C2H5OH(酒精)+2CO2↑

在酿酒过程中，乙醇被保留下来；在烤面包或蒸馒头的过程中，二氧化碳将面团发起，而酒精则挥发。

多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果（葡萄、苹果、桃等）或者植物分泌物（如仙人掌的汁）。一些酵母在昆虫体内生活。酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5微米′5~30微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。　酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。酵母菌的细胞形态酵母菌的细胞形态酵母菌细胞结构的显微照片酵母菌的菌落。

大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。　啤酒酵母的菌落红酵母的菌落各种酵母菌的菌落。 拉丁名（Arabidopsisthaliana）十字花科。二年生草本，高7～40厘米。基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶无柄，披针形或线形。总状花序顶生，花瓣4片，白色，匙形。长角果线形，长1～15厘米。花期3～5月。我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有发现。拟南芥的优点是植株小（1个茶杯可种植好几棵）、每代时间短（从发芽到开花不超过6周）、结子多（每棵植物可产很多粒种子）、生活力强（用普通培养基就可作人工培养）。

拟南芥反向演化

①组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。目前使用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 启动子、来自根癌农杆菌Ti 质粒T-DNA 区域的胭脂碱合成酶基因nos 启动子，后者虽来自细菌，但具有植物启动子的特性。

在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子，双子叶植 物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子，它具多种顺式作用元件。其转录起始位点上游-343～-46bp是转录增强区 ，-343～-208和-208～-90bp是转录激活区，-90～-46bp是进一步增强转录活性的区域，在了解CaMV 35S启动子各种顺式作用元件的基础上，人 们利用它的核心序列构建人工启动子，以得到转录活性更高的启动子，Mitsuhara等利用CaMv 35s核心启动子与CaMV 35S启动子的5'端不同区段 和烟草花叶病毒的5'非转录区（omega序列）相连，发现把两个CaMV 35S启动子-419～-90（E12）序列与omega序列串联，在转基因烟草中GUS有 最大的表达活性，把7个CaMV35S启动子的-290～-90（E7）序列与omega序列串联，非常适合驱动外源基因在水稻中的表达。用这两种结构驱动 GUS基因表达，在转基因烟草和水稻中GUS活性比单用CaMV 35S启动子高20～70倍。

另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯叶脉花叶病毒（cassava vein mosaic virus )中分离的。该启动子 -222～-173bp负责驱动基因在植物绿色组织和根尖中表达，其中-219/-203是TGACG重复基序，即as1 (activating sequence 1)，-183/-180为 GATA（又称为as2），这两个元件的互作对控制基因在绿色组织中表达至关重要。该启动子-178～-63bp包含负责调控基因在维管组织中表达的 元件。CsVMV启动子在转基因葡萄中驱动外源基因的转录能力与使用两个串联的CaMV35S启动子相当，两个串联的CsVMV启动子转录活性更强。 Rance等利用CoYMV(commelina yellow mosaic virus)，CsVMV启动子区和CaMV 35S启动子的激活序列(as1，as2)人工构建高效融合启动子，瞬 时表达实验表明该启动子可驱动报告基因在双子叶植物烟草中高效表达，在单子叶植物玉米中其驱动能力比通常使用的γ玉米蛋白启动子高6倍。因此用这种人工构建的高效 启动子驱动抗病基因或目的蛋白基因，在双子叶和单子叶植物中均可达到较理想的效果。

人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子，并初见成效，例如肌动蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β 亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果。

由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达，应用中逐渐暴露出一些问题。例如外源基因在 整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻 碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。另外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象。因此， 人们寻找更为有效的组织、器官特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控植物基因表达。

②组织特异启动子(tissue-specific promoter)又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。例如烟草的花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29，豌豆的豆清蛋白(leguimin)基因启动子可在转化植物种子中特异性表达，马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)基因启动子在块茎中优势表达。

21根特异启动子

根的发生和发育是植物发育过程中的重要问题，研究根中特异表达基因及其启动子无疑是重要的。拟南芥根中特异表达的黑芥子酶(myrosinase)是由Pyk10基因编码的。Pyk10启动子中存在若干器官特异性表达和 植物激素应答的特异元件，如ACGT-核心序列、CANNTG-motifs、GATA-motifs、诱导物(elicitor)应答元件W-box((T)TGAC(C))、植物激素应答 元件(如as-1元件、生长素和脱落酸应答元件、Myb元件)和细胞特异表达元件等。其中ACGT，CANNTG，GATA等顺式作用元件是决定组织器官特异 表达的转录因子结合位点，Myb元件在控制植物次生代谢、调节细胞形态建成及信号传导通路中起作用。

根特异表达系统可用于研究转基因植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等问题。BoriSjuk等用根特异启动 子mas2'，GFP和烟草钙网蛋白(calreticulin)基因构建融合表达载体，水培转基因烟草结果表明，根细胞不仅能够高效生产GFP，而且可将目的 蛋白质分泌到液体培养基中。因此利用该启动子与其他有用的能编码蛋白质的基因融合，不仅可大量生产目的蛋白质，且更便于回收产物。

22 茎特异启动子

Trindade等利用cDNA-AFLP技术从马铃薯中分离了一个与乙醇脱氢酶非常相似的TDF511(transcript derived fragment)，其基因Stgan可能参与植物体内影响赤霉素水平的复合物的合成。在NCBI数据库中，比较Stgan启动子与马铃薯的patatin Ⅰ和Ⅱ、 蛋白酶抑制子、nodulin 22K和23K等编码蛋白质基因的启动子，发现它们包含一些可能与蔗糖应答反应有关的共有序列；该启动子还包含植物 中几个保守的转录因子(如Dof1，Dof2，Dof3和PBF)的结合位点。构建Stgan启动子-GUS融合表达载体转化烟草，GUS组织化学染色显示该启动子 驱动基因在茎结节处特异表达，可能参与块茎形成过程。

研究在茎中特异表达基因的启动子，不仅可从分子水平了解茎的发生、分化过程，更重要的是利用这些启动子调 节植物代谢可满足人类需求，如人们对木质素生物合成及其调控的研究。木质素是植物体内仅次于纤维素的一种含量丰富而重要的有机大分子 物质，它的存在对于增加植物机械强度、远距离水分运输和抵抗外界不良环境的侵袭都是非常有益的。然而，木质素的存在也有一定的负面作 用。因此，人们希望通过调节木质素的合成以降低其含量。目前多使用CaMV35S启动子驱动目的基因，近年来已分离一些木质素生物合成途径中 关键酶基因的启动子，如4CL，F5H等基因的启动子，人们正在尝试利用这些特异性启动子来调节木质素的生物合成。Bell-Lelong等已从拟南芥 中分离了肉桂酸羟-4-基化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)基因的启动子，本实验室首次从毛白杨中分离了C4H启动子，并对该启动子的功 能进行了初步鉴定。GUS组织化学染色和GUS荧光测定结果表明。G4H启动子驱动外源基因在烟草茎的维管组织中丰富表达，有望将来利用该启动 子驱动功能基因调控木质素的生物合成过程。

23 叶特异启动子

Marraccini等从咖啡(coffea arabica)中克隆了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)小亚基基因RBCS1， 该基因在一年生植物咖啡的叶中特异表达。研究发现RBCS1启动子上游GTGGTTAAT序列与豌豆RBCS3A启动子的BoxⅡ核心序列相同；在其启动子G -box(GCCACGTGGC)两侧分别有一个类I-box(核心序列为GATAAG)，形成I-G-I结构，推测G-box十个碱基的回文结构可能结合某个转录因子；其AT-1 box(AGAATTTTTATT) 与其他RBCS和CAB基因的AT-1 box(AATATTTTTATT)相比只有两个碱基不同；类L-box(AAAATTAACCAA)与马铃薯RBCS1和RBCS3A启动子的相同。由此 可见，植物叶特异表达顺式元件具高度保守性。

有趣的是Taniguchi等在玉米中发现了一个双元启动子系统(dual promoter system)。PPDK(pyruvate， orthophosphate dikinase)是C4植物光合反应中的一个叶绿体酶，该酶基因Pdk具有一个双元启动子系统(C4Pdk启动子和细胞质Pdk启动子)。这 两个启动子的区别在于起始密码子和拼接方式的差异，C4Pdk启动子驱动Pdk转录成较长的mRNA。基因产物定位在叶绿体中；细胞质Pdk启动子在 Pdk基因的第一个内含子中，驱动Pdk转录成较短的mRNA，它所编码的蛋白质定位于细胞质中，又称为细胞质Pdk启动子。C4Pdk启动子是受光诱 导的强启动子，驱动基因在玉米叶肉细胞中特异表达；而细胞质Pdk启动子是个弱启动子，且不具有组织特异性。大多数C4植物的光合作用相关 基因的表达具有细胞特异性，且主要在转录水平调节基因表达活性，因此，可利用该启动子在C4植物叶肉细胞中高效表达外源基因。

24 花特异启动子

高等植物发育过程中花器官的形成是一个十分复杂的过程，它包括一系列器官分化及严格控制的细胞及生化变化 ，同时伴随大量基因的协同表达。目前人们最为关注的是花药中特异表达的基因，抑制或破坏这些基因的表达可导致雄性不育，即可利用基因 工程的方法创造雄性不育系。

人们克隆了许多花药特异表达的基因，如在花药绒毡层特异表达的TA29，A9、在花粉壁特异表达的Bp4A等，但这 些基因都是在花药营养细胞中表达，与生殖细胞的分化无关。Singh等从百合(Lilium longiflorum)中克隆了一个LGC1基因的启动子，该启动子 驱动的基因只在雄配子细胞中表达。LGC1启动子-242～-183 bp之间可能包含某种顺式作用元件，它的缺失会导致细胞特异性表达特性丧失，由 此可知LGC1在生殖细胞中的表达特异性可能是由于其他细胞中存在某些转录因子抑制该基因表达的结果。这是迄今为止发现的第一个有关雄配 子细胞特异性的启动子，在研究花药发生和受精作用中将会是一个有用的工具。

25 果实、种子特异性启动子

利用果实或种子等器官特异性启动子调控基因表达，不仅可提高基因在这些部位的表达量，将生物能耗降到最低 ，利于表达产物的分离，而且可有目的地提高转基因植物果实或种子的营养或改善其品质。

番茄E8启动子是成熟果实中乙烯应答性基因的启动子，其-409～-263bp可控制E8基因在果实成熟过程中特异表达 ，-2181～-1088bp为乙烯应答激活域。Sandhu等利用E8启动子驱动呼吸道合胞病毒F抗原基因成功转化番茄植株，用果实特异表达抗原喂饲小鼠，可诱导小鼠产生特异 的粘膜免疫反应、血清学抗体反应及TH1型细胞免疫反应。基因表达调控与免疫学的有效结合，使得转基因植物口服疫苗可在不久的将来问世。 2A12是番茄中另一种果实特异性启动子，毛自朝等利用该启动子驱动ipt调节果实内源激素的含量，不仅可获得无籽果实，还能改善果实的品质 。

种子特异性启动子中研究较多的是胚乳特异性谷蛋白基因启动子。谷蛋白占水稻种子储藏蛋白总量的70%～80% ，早在1986年Takaiwa等就克隆了第一个水稻谷蛋白基因的cDNA。该基因转录起始位点-261～-1 bp之间有若干控制种子特异性表达的顺式作用元件，如AACA-box、种子凝集 素-box、未成熟种子核因子结合位点等。此外，启动子更上游处还有若干增强子和调节元件，如-300bp处的RY重复序列，它是核蛋白的结合位 点。Yoshihara等研究发现水稻谷蛋白启动子上游-104～-60bp之间有两个顺式作用元件AACA和GCN4，GCN4能增强启动子的活性，而启动子的组织特异性则须两者协同作用。

虽然植物食物中包含人类营养所需的绝大多数矿物质和有机养分，但日常摄入的食物往往不足以提供人体所需的 营养。因此人们希望通过植物基因工程提高植物中所含的营养物质。水稻谷粒中含有铁蛋白，但多积累在糊粉层，在谷粒加工过程中会失去很 多铁。Vasconcelos等用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因，使转基因水稻谷粒中铁和锌的含量都有所增加，而且铁蛋白主 要积累在胚乳中，不会在食品加工过程中丢失。无独有偶，Datta等利用水稻谷蛋白特异启动子驱动八氢番茄红素合酶基因PSY，在水稻胚乳中 成功合成维他命原A。

以植物为生物反应器生产生物可降解塑料是本实验室研究目标之一。叶梁等使用大豆7S种子特异性启动子，构建 二价和三价种子特异性表达载体转化油菜。这样将产物聚-3-羟基丁酸酯(PHB)定位与种子质体中，不仅增加了底物供应，也减少PHB对植物生长 发育的影响。为优化已有表达框架，减小基因沉默发生几率，Zhang等从油菜H165基因组DNA中分离到napinB启动子的部分序列——nap300。序 列分析表明，napinB启动子包含一些在进化上保守性很高的序列，如AT-rich sequenc，TACACAT保守序列、RY重复序列、G-box等，这些顺式作 用元件可能对种子特异性表达起重要的调控作用。将nap300与GUS基因融合转化烟草，GUS在胚和胚乳中均有表达；GUS荧光检测显示nap300启动 子具有驱动基因在种子发育晚期表达的能力。

③诱导型启动子(inducible promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。

31天然诱导型启动子

长期进化过程中，植物通过启动不同基因的表达可在一定范围内适应光、温、水等环境的变化。这些基因的启动 子通常包含比较保守的顺式作用元件，利用这些保守元件可以推测新基因的可能功能，也可用这些环境应答基因的启动子与抗逆基因融合，从 而使转基因植物更好地适应逆境。

天然诱导型启动子包括光、温度、激素应答启动子等。光应答启动子中通常存在GT-1-motif，I-box，G-box和 AT-rich sequence等顺式作用元件；温度应答启动子中多存在HSE-motif，CCAAT-box，CCGAC-motif等；激素应答启动子中则包含各种激素应答 元件。G-box作为蛋白结合的一个高度保守的位点，是植物中通用的受信号诱导的顺式作用元件，在植物和动物中具高度保守的核心序列CACGT 。G-box通常与另外一个顺式作用元件如I-box，H-box等协同作用，在细胞接受外界信号时调节转录起始的频率。这种机制可能是通过G-box及 其结合蛋白相互作用产生一个内部环境，其他调节蛋白与启动子区域有效结合，使细胞准确而有选择地起始转录。

有些诱导型启动子同时具有组织特异性，如RBCS1启动子，既包含叶特异表达元件，又带有几个光应答元件 (LREs)，受光的诱导调节。当转基因烟草由光照转入黑暗时，该启动子驱动的GUS活性比在光下低许多，Northern杂交几乎检测不到GUS的表达。

由于植物生长环境及基因表达的复杂性，从外界环境的刺激到启动应答基因的表达之间的信号通路往往是相互交 叉的，这样启动子中包含的顺式作用元件通常也不止一种，如从葡萄中克隆的白藜芦醇合酶基因Vst1启动子，当病虫侵害、UV照射、臭氧环境 或化学物质诱导时均可启动Vst1的表达。Riou等发现该启动子上分别带有乙烯和臭氧的应答元件，可适应不同的外界刺激。拟南芥rd29A基因在 干旱、高盐碱、低温或脱落酸诱导时表达。其启动子-174～-55区域包含干旱应答因子(DRE，TACCGACAT)和ABA应答因子(ABRE，ACGTGG/TC)，且 该基因在ABA诱导表达时，DRE和ABRE是相互独立的。

当植物受病虫害侵犯时，受伤部位会立刻启动细胞程序性死亡，即发生所谓超敏反应(hypersensitive response 。HR)。HR通常会启动未受伤部位产生次级防御反应，从而对一般的病虫害产生普遍抗性，这种现象称为系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)。烟草中SAR基因是一个至少包含十二个成员的家族，SAR也受一些诸如水杨酸(SA)，INA(dichloroisonicotinic acid)和 BTH(benzothiadiazole)等化学物诱导。烟草Sat82b基因启动子-205/-201是as-1元件(TGACG)，-146/-141和-276/-271为两个GT-1结合序列 (GGAAAT)，-97/-94、-322/-318和-761/-758分别是Dof结合基序(AAAG)，前两者被认为可以与SA应答的转录因子结合而起关键作用。启动子缺 失实验表明Sar82b启动子-927～-728和-351～-197bp分别包含有SAR高效诱导基因表达所需的顺式作用元件，缺少了这两个DNA片段。转基因烟 草GUS表达活性明显降低。

32 人工构建的诱导型启动子

在开发植物天然存在的诱导型启动子的基础上。人工构建可诱导表达系统以满足不同需求。目前研究最多、最深 入的可诱导表达系统是化学诱导表达系统。自第一次用化学诱导表达系统TetR，通过CaMV35S启动子成功调节cat基因的表达以来已有20多年的 历史，现已发展成日臻完善的植物表达外源基因的可诱导表达系统。该系统包括两个转录单元：一是与化学诱导物结合的转录因子的表达，另 一个转录单元包含一个应答元件，经诱导物处理后，通过它激活转录因子，从而激活或抑制目的基因的表达。

一个理想的化学诱导表达系统应具备以下特点：首先，外源基因在植物体自身不表达或低水平表达，当添加诱导 物后，高效诱导基因表达；其次，诱导物需要有较强的专一性；第三，诱导物可快速启动基因表达的“开”与“关”；而且诱导物对植物无毒 或低毒。根据控制基因表达的方式，可将化学诱导系统分为两大类：阻遏型启动子系统和激活型启动子系统。

321 阻遏型启动子系统

该系统建立在阻遏蛋白与转录因子在空间构型相互作用的基础之上。当诱导物不存在时，激活蛋白与阻遏蛋白结 合，基因正常转录；添加诱导物后，诱导物与激活蛋白结合或阻止其与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白则与启动子上的某些顺式作用元件结合，抑制 基因转录，如以四环素抑制子为基础的四环素抑制系统(tTA)。Love等用包含四环素抑制子的启动子Topl0与报告基因GFP相连转化拟南芥，发现 用100 ng/mL的四环素即可抑制GFP的表达，而且改变培养基中四环素的浓度，可调节GFP的表达水平。

322 激活型启动子系统

在抑制型启动子系统中，抑制基因转录所需诱导物的量往往超出植物适应的范围，而且在真核生物中激活基因比 抑制基因转录更容易，近年发展了一些激活型启动子系统，如地塞米松诱导的GR系统、雌二醇诱导的ER系统、杀虫剂诱导的EcR系统等。激活型 启动子系统的优点是只有当诱导物存在时才能启动基因表达，去除诱导物后，基因表达很快被关闭，这样就可以人为地精确、快速控制基因的表 达。

Bohner等研究了一种可双向调控外源基因表达的系统，他们将改造的启动子Top10与报告基因GUS相连，使用转录 激活子TGV作为基因开关。转基因烟草结果表明，用地塞米松处理3小时后基因表达量达到高峰；用四环素处理6小时即可关闭基因表达。该诱导 系统最大的优点在于可迅速调节基因的表达与否，当外源基因可能对植物产生不良影响时这一点显得尤为重要。

为了满足应用需要，人们开始研究便于在大田使用的诱导表达系统，杀虫剂诱导的EcR系统就是一个很好的范例 。Unger等利用欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的蜕皮激素配基结合结构域(EcR LBD)、玉米C1激活域(AD)和GAL4 DNA结合结构域(DBD)构建化 学诱导激活子，把它与玉米ms45最小启动子相连，构建成可受杀虫剂诱导的人工启动子诱导系统。他们利用该系统在玉米雄性不育突变株ms45 中成功地诱导了育性恢复基因MS45的表达

在国际上，斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入到生命体的多种系统（例如，神经系统、免疫系统、心血管系统、生殖系统等）的发育、功能和疾病（例如，神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等）的研究中，并已应用于小分子化合物的大规模新药筛选。我国开展斑马鱼相关的研究无论在规模还是在重视程度上都远远落后于国际形势发展的需要。推动和发展斑马鱼模式生物在我国生命科学研究中的广泛使用是本中心的宗旨。在国家科技部重大科学研究计划的支持下，我们汇集优势，整合我国现有的斑马鱼主要研究力量，在未来几年内逐步建立全国共享的斑马鱼模式动物研究技术和资源库，向国内同行提供斑马鱼资源、信息和技术支撑。本着提高服务效率和质量为原则，我们在上海和北京分别建立国家斑马鱼模式动物南方中心和北方中心。南方中心依托于中国科学院上海生命科学研究院，北方中心依托于北京大学和清华大学。两个中心本着优势互补的原则，共同开发研究技术和资源，以辐射状向国内研究人员提供服务，积极推进我国斑马鱼相关科学研究。

主要技术和资源服务内容： 斑马鱼基因表达分析服务：包括抽提斑马鱼基因组DNA和总RNA，核酸原位杂交探针制备和纯化，全胚胎原位杂交技术，显微注射技术，基因过表达（over-expression）和基因下调（morpholino knockdown）技术 斑马鱼转基因技术服务：包括各类斑马鱼非特异性和组织特异性启动子的克隆，基因组BAC文库筛选与修饰，基于Tol2转座子的转基因质粒的构建，以及子一代转基因系的筛选和保存 斑马鱼基因功能活体检测服务：包括清醒斑马鱼在体共聚焦/双光子显微镜成像技术和在体电生理记录技术 动物行为范式分析服务：包括感觉相关的应激行为、视觉运动行为、学习记忆行为和药物成瘾行为等 斑马鱼基因突变技术服务：包括插入诱变和ENU化学诱变技术。 斑马鱼转基因资源库和突变体资源库服务：包括研制、收集和分发各种斑马鱼转基因品系和突变体 信息服务：包括建立斑马鱼资源信息网络数据库和提供斑马鱼基因组生物信息学分析服务。 转基因斑马鱼的制备主要采用两种方法：通过Tol2转座子构建组织特异性表达报告基因的方法；利用特定基因的启动子/增强子驱动报告基因在特定细胞组织中表达的方法。

首先构建以Tol2转座子为基础的enhancer trap载体，

报告基因选用GFP或RFP，最小启动子来自斑马鱼gata2基因；将上述载体与体外转录得到的Tol2转座酶的mRNA共同注射到斑马鱼的单细胞受精卵中，受精卵长大后成为founder；Founder外交（out-cross）得到F1代胚胎，从中挑选出对于报告基因具有组织特异性表达模式的胚胎，拍照记录后分类培养；F1长大后通过linker-mediated PCR的方法鉴定对应于GFP（或RFP）表达图式的Tol2插入位点，并通过与已知基因组数据比较，对插入位点进行定位与分析；通过外交纯化得到转基因鱼，直至得到只含有单个插入品系的转基因鱼。通过克隆特定基因的启动子/增强子或BAC修饰法构建在特定组织器官或特定胚胎发育阶段表达报告基因的转基因品系。BAC方法如下：在斑马鱼基因组计划网站上通过BLAST将感兴趣的基因定位到已知的contig上，并通过contig信息寻找包含所选基因的BAC ID号；通过同源重组的方法对上述BAC克隆进行修饰，将报告基因引入原有的BAC克隆；将修饰过的BAC克隆通过显微注射的方法引入斑马鱼受精卵，连续观察并挑选具有特异表达模式的转基因鱼；将上述成鱼外交得到F1代，在F1代中筛选具有特异表达模式的成鱼，即得到所需的转基因品系。

各国研究者成立了跨国哮喘遗传学联合会（TAGC）。研究小组利用TAGC数据，对142000人的数据进行分析，构建了不易受人种和环境影响的18个哮喘风险基因座与878个单核苷酸多态性（SNP）综合目录，找到了5个新的哮喘风险基因座，并在哮喘和花粉症并发症相关的两个已知基因座中，确认了新的与哮喘相关SNP。通过将这些哮喘相关SNP名单与已知的数据库组合分析，研究人员发现，自我免疫疾病和炎症性疾病相关SNP有较大重合。同时，哮喘相关SNP集中在免疫细胞的增强子附近，可能负责免疫相关的控制机能。

多因素疾病哮喘的患病率，日本人为5%至8%；在美国，墨西哥裔为39%，非洲裔为125%。哮喘患者中，推算遗传因素贡献率约占25%至80%。患病率与贡献率推定值相差如此之大，是因为哮喘容易被环境所左右，症状也千差万别。而近20年来发现的与哮喘相关的基因座仅有21个。

不知道你要克隆什么基因的启动子？

一般而言，如果是与模式生物亲缘关系较近的生物中克隆某基因的启动子，可以查询模式生物该基因的sequence viewer相关信息，这个在拟南芥数据库以及NCBI中都可以实现。相关 *** 作内容可以参阅本论坛中关于NCBI使用方法的一些帖子。

查到sequence viewer后，选取该基因5‘UTR上游2000bp的序列作为你的目的序列，然后与你的基因的已知序列（我想，在克隆启动子之前，你应该至少已经有你的目的基因的CDS了吧？）ATG下游序列进行拼接，然后利用你查到的序列设计F引物，利用你已知的目的基因序列设计R引物，再按照常规PCR进行后续试验即可！

对于那些与模式生物亲缘关系较远的生物而言，我建议你在CNKI上输入“启动子克隆”为关键词查一下，你会发现，应该有很多人总结过这方面的技术的！

另外，我这还有几种方法，需要M我

一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ 多l 克隆位点：MCS 克隆携带外源基因片段 P/E：启动子/增强子 Terms：终止信号 加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA 作用 。

二、如何阅读质粒图谱

第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） Ori 的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。

第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记：

（1）Ampr：水解β -内酰胺环，解除氨苄的毒性。

（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。

（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。

（5）hygr：使潮霉素β 失活。

第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源DNA 片段。

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