touchdownpcr怎么抑制非特异性条带

1. 保持反应冷静

在热循环开始之前保持所有反应低温对于避免非特异性启动至关重要，即使是使用TouchdownPCR。

2.使用热启动设置

一旦您的反应准备就绪，最好使用热启动设置，进一步减少初始循环期间的非特异性相互作用。

3.考虑添加剂

如果使用Touchdown PCR 时仍然遇到问题，请考虑将其与添加剂结合使用。

4. 保持低周期数

太多循环会导致凝胶中出现非特异性条带，表明非特异性扩增。为限制这种情况，请将 PCR 扩增循环的总数保持在 35 以下。

5. 添加一个额外的变性循环

在 96°C 或 97°C 下额外 1 分钟的变性循环对于困难的模板可能非常有用。

熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，

同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的

Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。

有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。

根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃

或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

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