如何使用Mfold软件？预测RNA的二级结构？

预测RNA二级结构如下进行：

1. 选择file|RNA fold single strand启动模块，单击sequence按键，打开对话框以载入序列，此序列必需以.SEQ为扩展文件名，其它序列文件可在序列编辑器中转为此格式。注意必需为大写字母。

2. 输入文件名后，缺省值将填充在剩下的区域，这些值可改变。选取 Generate Save File选项，在执行算法后生成存盘文件，此存盘文件用于重新折叠与生成点阵图。

3. 在此碱基可被强制为单链或双链或螺旋。

4. 单击开始键，开始预测运算。

5. 需要的话，选择Draw structure，在绘图模块中看预测的二级结构结果。输出的二级结构以最小自由能顺序排列。但由于方法的限制与热力学参数的简化，第一个结构并不一定为实际的RNA结构，

要折叠一个已存贮为.seq文件的序列，可选择菜单选项file|fold RNA single strand，直接进入折叠窗口。或单击工具条中的fold RNA single strand键。

折叠RNA单链

次优结构输出的数量由用户输入的两个参数决定。

Max % Energy Difference:设定输出结构的自由能允许与最小自由能相差的百分数。例如如果结构的最小自由能为-100 kcal/mol，最大能量百分误差为10,将输出所有能量为等于或大于-90 kcal/mol的结构。

Max number of structures: 设定生成的结构数量。最大为1000.

程序输出预测结构直到以上任何一个参数达到要求。

Window size:此参数控制次优结构互相之间有多少不同。小的Windows size只允许生成非常接近的结构，大的Windows size则需要更大的不同。

Advanced Options:除非特殊情况，不推荐使用。

RNA折叠单链模块

强制一个碱基为单链

在二级结构预测时，用户可选择不配对的碱基。方法如下：

1. 在序列文件中，不配对碱基使用小写字母表示。

2. 选择要折叠的序列后，选择Force/Single菜单，进入文本编辑框，输入不配对碱基从5'端的位置序号。单击OK。

查看目前的选择碱基，选择Force|Current.重新设定选择碱基，选择Force|Reset.菜单命令。

强制一个碱基为双链

用户能选择必须配对的碱基，由Force|Double菜单命令完成， *** 作类似上述。

RNA折叠单链模块

强制一个碱基对

选择菜单命令Force|Pair.完成。

折叠模块

使用限制

尽管作者努力，预测的最低自由能结构可能并不是自然界存在的形式，特别当序列长度为几百时，但至少其可能的结构已限制在一定数量内。

最近的研究证明最低自由能结构，含有大约70%正确的碱基对，但前1000个最佳次优结构中的一个结构会含有大于95%的正确的碱基对。因此建议进行实验以限制预测的结构。例如，化学修饰数据可帮助识别存在与自然界中的结构。Mix&Match模块的功能便是帮助你使用此类数据识别最可能自然结构。

RNAstructure现在也提供其它几种折叠的预测，如单链DNA折叠，RNA或DNA寡聚体的分子间折叠。并提供重新折叠选项refold重新生成已折叠序列的次优结构。

单链DNA折叠

使用John SantaLucia, Jr.及其同事提供的热力学参数，也可折叠DNA序列。

RNA或DNA分子间折叠

可使用RNA或DNA参数确定寡聚体的分子间二级结构，这需要选定两个序列。

分子间折叠使用初始参数以正确决定自由能。但也有一些限制。程序算法不能预测pseudoknots，对于分子间折叠意味着pseudoknots结构如kissing hairpins结构不能被正确预测，因此，使用的分子间折叠的序列应很短。

Refold

重新折叠选项可读取一个由任何折叠模块生成的存盘文件*.sav，并生成一个不同的次优结构。因为程序算法分为两部门，因此这功能非常有帮助。第一步是非常慢的一步，重新折叠便读取第一步的数据快速生成其它结构。

EFN2 能量函数2

此模块计算结构的自由能

1. 单击.CT File按键,打开对话框输入.CT文件的名字，这是一个含有二级结构信息的文件格式，以CT为扩展名。

2. 对于输出文件.OUT，给出了缺省名称，可单击Out file 按键更改

3. 单击Start 按键

4. 输出两个文本文件扩展名分别为.CT与.OUT。

5. 使用文本文件编辑器打开文件，

6. 结构以自由能大小排列，

绘图模块

1 选择菜单命令File|Draw.

2. 选择一个已存在的.CT文件绘图

如果.CT文件含有超过一个结构，可以选择观看哪个结构。在菜单中选择View|Structure number，选择想要观看的结构。或按住Control键按动上箭头或下箭头也可更改现有显示结构。

放大缩小

选择View|Zoom或按住Control键按动左箭头或右箭头。

打印

选择File|Print.

拷贝到剪贴板

选择Copy菜单place a black and white bitmap on the clipboard将其拷贝到剪贴板，并可复制到其它应用程序。

可在view|counterclockwise菜单选项选择是顺时针还是逆时针绘图。

About microRNA

microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。动物miRNA主要是通过翻译抑制来调控基因的表达。不同的是, 植物miRNA主要是引起靶基因mRNA的降解。大多数miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster) 的形式存在于基因组中。研究表明大约70 %的哺乳动物miRNA 基因是位于TUs区( transcription units , TUs ), 且其中大部分是位于内含子区。在人基因组中已经发现1000多个microRNA, 调控超过30%的人编码基因的表达。在不同的物种中累积发现了数千个microRNA。依据生物信息学数据预测，人基因组中编码着超过25,000个microRNA，绝大部分仍然有待实验数据发现和证实。

microRNA在进化中受到很强的选择压力，其序列在多细胞生物物种之间呈现高度的保守性，表明其参与许多重要的生物学事件包括细胞增值，分化，凋亡，代谢和压力应激等。microRNA在表观遗传学和疾病发生中也有重要作用。

microRNA的发现

第一个microRNA基因，lin-4，分别由Gary和Victor于1993年研究线虫发育缺陷时发现的,它通过与靶基因lin-14mRNA3′UTR 区互补配对, 从而抑制Lin-14 蛋白质的翻译表达。这些研究在科学界并没有引起太多的重视，直到2000年Gary在线虫中发现第二个microRNA基因，let-7，并在人基因组中找到同源基因。至此，人们认识到microRNA代表了一种高度保守的基因表达调控机制。但研究microRNA的浪潮并没有因此展开，直到1年之后在Science杂志同期刊登的三篇标志性的文章分别发现在果蝇，线虫和哺乳动物细胞中存在着大量的，非编码的小RNA家族。至此，这一类新型小RNA分子有了其新的名字，microRNA，对这类分子的研究迅速扩展到整个科学界。

microRNA的生物发生机制

编码microRNA的基因，许多成簇分布在基因组中，并以多顺反子形式串联在一起转录。还有一些单独表达或者编码在蛋白表达基因中。依据其在基因组中的分布，可以将microRNA分为以下2类：

1，基因间microRNA，microRNA编码基因位于蛋白编码基因之间。

2，基因内microRNA，microRNA编码基因位于蛋白编码基因内。

研究发现这一类microRNA可以位于蛋白编码基因的内含子，外显子 ，3’UTR和 5’UTR 区。现有数据表明，人microRNA编码基因大部分位于基因间(42%)和蛋白编码基因的内含子区(44%)。显然，microRNA编码基因可以独立存在或者依托于蛋白编码基因存在，因此其转录表达机制也相应被分为两类(见图1和图2)。整个过程大致可以分为5个步骤：图示基因间microRNA的生成：基因间microRNA有独立的编码基因，主要由RNA聚合酶III转录产生。

1),转录产生初始microRNA(pri-miRNA): 转录microRNA。基因间microRNA主要由RNA聚合酶II或III转录产生一个初始的长转录链，称为pri-miRNAs，在完成5’端加帽和3’添加polyA尾后，可以达到几Kb长。内含子microRNA在RNA聚合酶II转录产生mRNA后，经由RNA剪切产生初始microRNA。

2),产生microRNA前体(pre-miRNA)：内切酶剪切pri-miRNAs。RNA内切酶III(Drosha)，以及DGCR8 /Pasha负责将pri-miRNA剪切成60至100 nts长的pre-miRNAs。含有初始miRNA的内含子被称为mirtron，其从编码蛋白的初始mRNA的内含子区剪切出来后，折叠成一个和pre-miRNAs结构非常类似的发夹结构，并随后进入miRNA加工程序。

3),将pre-miRNA从核内运输至细胞质中：这个过程主要由RanGTP和exprotin-5完成。

4),产生成熟的miRNA：内切酶剪切pre-miRNA。在细胞质中，Dicer进一步将pre-miRNA剪切成约22nt长的双链成熟miRNA。图示基因内microRNA的生成：基因内microRNA(多为内含子miRNA)经由蛋白编码基因的mRNA剪切产生，因此主要由RNA聚合酶II转录产生。

5),形成miRISC。成熟miRNA双链的结合RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。成熟的miRNA双链只有一条向导链可以进入RISC复合物，另一条链则被去除。miRISC复合物中含有Dicer，TRBP,PACT和Gemin3,然而直接和miRNA结合的是Argonaute因子，其可以介导miRNA和目的mRNA的序列匹配以导致随后的翻译抑制。人Ago2因子同时还具有核酸酶活性，所以其不仅可以参与组成miRISC复合物，还与其它蛋白形成siRISC(siRNA-induced silencing complex)复合物，负责处理外源的siRNA。

microRNA的作用机制

microRNA以双链形式存在，激活时呈单链形式，并且通过miRISC复合物发生作用。miRISC复合物中的单链miRNA的5’端的第2至第8nt的序列部分与目的mRNA的靶序列部分完全匹配，miRNA的这部分序列被称为种子序列(seed site)，是miRNA发挥作用的核心序列。其它序列的部分匹配有助于稳定miRNA:mRNA相互作用。其中间和3’端部分有助于形成miRISC复合物。mRNA的5’端和3’端 UTR区以及内含子区，编码区都发现有miRNA的结合位点。依据具体情况的不同，miRNA既可以抑制目的基因的翻译，也可以降解目的mRNA。

1), 完全匹配的序列的长度。匹配序列越长，越倾向于降解目的mRNA。至今发现的大部分都是部分匹配。只有种子序列的或者种子序列之外的部分匹配度不高的miRNA主要通过翻译抑制沉默基因表达。

2), 目的mRNA中miRNA识别位点的数目。数目越多，其作用机制越倾向于降解途径。

3), 识别位点的空间位阻。空间位阻决定了miRNA:mRNA序列匹配能力，因此也决定了降解和翻译抑制机制的选择。

RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。RNA干扰(RNA interference)的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化/替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。有人推测：小分子RNA可能代表发现了一个新层次上的基因表达调控方式。生物通早在去年底到今年初已经有很多文章介绍有关siRNAs以及其在RNA干扰中的作用以及研究应用方法，在这里生物通继续为我们的用户介绍另一种越来越引人注目的小分子RNA——microRNA。 什么是miRNA MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA(双链)但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA(miRNAs)参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。 miRNA 的特征 已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21—25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。 最近3个研究小组分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定的100个新miRNAs中，有15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组具有高度的保守性(只有有1—2个碱基的区别)，Lau 和Bartel 实验室的同事更加认为：所有的miRNAs可能在其他物种中具有直向同源物(Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物体中行使同一功能的基因群就可比作为一个门类，这些类似的基因被称为“直向同源物”)。 Bantam 最早被认为是果蝇中参与细胞增殖的一个基因位点。已知几个包含增强子的转座子插入跨越这个位点的一段12.3kb区域会导致果蝇的眼和翅重复生长，而由转座子介导的一段跨越该位点的23kb片断缺失则导致突变果蝇个体小于野生型果蝇。Cohen和同事用一段3.85kb的片断导入21kb片断缺失的果蝇中使其恢复原来的大小。但是奇怪的是表达这个3.85kb片断中的EST却没有同样的效果。Cohen将这个片断和疟蚊Anopheles gambiae的同源序列进行比较，发现一段90bp的高度保守区，经过RNA folding program (mfold)发现这个保守序列可以形成发夹结构，使得这个区段很象是一个miRNA的前体。这个结果经过Northern blot证实突变果蝇的幼体缺少一个21bp的bantam miRNA ，用这个90bp的mRNA前体经过一系列的“功能缺失”—“功能恢复”实验，证实 bantam miRNA在细胞增殖中的作用。研究人员用计算机程序检索在hid mRNA的3’非编码区找到了bantam的3个潜在的结合位点( hid是果蝇中一个诱导凋亡的基因)，并证实 bantam miRNA抑制hid 的翻译而非转录。 miRNAs的表达方式各不相同。部分线虫和果蝇的miRNA在各个发育阶段的全部细胞中都有表达，而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式(a more restricted spatial and temporal expression pattern)——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异。 miRNA的功能 对microRNAs (miRNAs)的研究正在不断增加，原因是科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNAs中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性( differential spatial and temporal expression patterns)，提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子，因而具有重要意义。 第一个被确认的miRNA——在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，可以通过部分互补结合到目的mRNA靶的3’非编码区(3’UTRs)，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，通过调控一组关键mRNAs的翻译从而调控线虫发育进程(reviewed in Pasquinelli 2002)。 bantam miRNA是第一个被发现有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知还有一些miRNAs可能参与在细胞分化和组织发育过程中起重要作用的基因的转录后调控，例如mir-14、mir-23 等。 在植物miRNAs的研究中有两条线索提示miRNAs可能参与植物的发育过程。一是在carpel factory (car) 突变株中3个miRNAs的表达水平显著下降。CARPEL FACTORY 是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育。 对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育(Reinhart 2000)，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡(Brennecke 2003)，脂肪代谢(Xu 2003)和细胞分化(Kawasaki 2003)。此外，一个研究表明，2个miRNAs水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关，提示miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系(Calin 2002)。 由于miRNAs存在的广泛性和多样性，提示miRNAs可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对miRNA的研究还处于初级阶段，据推测miRNAs在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是：miRNAs可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。 然而，大多数miRNAs的功能仍然是个谜。 miRNA的作用方式 最早被发现的两个miRNAs——lin-4 and let-7被认为是通过不完全互补结合到目标靶mRNA 3’非编码区端，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，阻断mRNA的翻译。多个果蝇miRNAs也被发现和他们的目标靶mRNAs的3’非编码区有部分同源。由于miRNAs和其潜在的目标靶之间并非完全互补，这使得通过信息学的方法鉴定miRNA的目标靶位点变得困难。因而也无法确定miRNAs的作用方式是什么，以何种机制影响mRNA的翻译，以何种方式调控基因表达。miRNAs的作用目标靶和活性机制一直是各地的研究人员的关注热点。 可以到生物帮那里详细的了解啊，有很多这方面的介绍的，我看到过，microRNA的生物方面的知识比较丰富，详细的，可以看下 www.bio1000.com/zt/rna/221892.html 应该可以帮你的

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