全基因组甲基化测序实验流程和分析思路的介绍。<p><p> 参考文献：<p><p> [1] Ashburner, M and C A Ball, et al Gene ontology: tool for th

全基因组DNA甲基化实验怎么做？从技术原理、建库测序流程、信息分析流程和研究套路等四方面详细介绍。

表观修饰不需要改变 DNA 序列便能实现对性状的改变，表观修饰的改变与基因功能乃至细胞状态、发育、衰老、疾病等存在重要的关联。在众多的表观遗传修饰中，最为重要且研究最为广泛的修饰之一是 DNA 甲基化，而全基因组甲基化测序（WGBS-seq）无疑是最有效的研究手段。

全基因组甲基化测序利用重亚硫酸盐能够将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为胸腺嘧啶 （T）的特性，将基因组用重亚硫酸盐处理后测序，即可根据单个 C 位点上未转化为 C 未转化为 T 的 reads 数目与所有覆盖的 reads 数目的比例，计算得到甲基化率。该技术对于全面研究胚胎发育、衰老机制、疾病发生发展的表观遗传机制，以及筛选疾病相关的表观遗传学标记位点具有重要的应用价值。

全基因组甲基化测序原理示意图入下：

样品检测——样品打断 ——文库构建——BS处理——文库质检

（一）样品检测

对DNA样品的检测主要包括2种方法：

（1）琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有污染，检测具有明显的主带，且条带清晰；

Qubit 20对DNA浓度进行精确定量，DNA检测总量不低于1ug。

（二）文库构建

样本检测合格后，使用Bioruptor系统将1µg样品基因组DNA与未甲基化的lambda DNA混合，然后将其片段化，平均大小约为250bp。片段化后，纯化的随机片段化DNA随后用T4 DNA聚合酶，Klenow片段和T4多核苷酸激酶的混合物进行修复，钝化和磷酸化末端。随后使用Klenow片段（3'-5'exo-）对钝的DNA片段进行3'腺苷酸化，然后与连接5'-甲基胞嘧啶而不是使用T4 DNA连接酶的胞嘧啶连接的衔接子进行连接。完成每个步骤后，使用磁珠纯化DNA。之后，根据说明使用ZYMO EZ DNA甲基化金试剂盒将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。最后，用JumpStart Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，再使用磁珠对PCR产物进行纯化获得最终文库。

（三）文库质检

文库构建完成后，先使用Qubit20进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度> 2nM），以保证文库质量。

（四）上机测序

文库检测合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后在illumina Nova平台测序，测序策略为PE150。

（一）原始下机数据质控

原始下机数据为FASTQ格式，是高通量测序的标准格式。FASTQ文件每四行为一个单位，包含一条测序序列（read）的信息。该单位第一行为read的ID，一般以@符号开头；第二行为测序的序列，也就是reads的序列；第三行一般是一个+号，或者与第一行的信息相同；第四行是碱基质量值，是对第二行序列的碱基的准确性的描述，一个碱基会对应一个碱基质量值，所以这一行和第二行的长度相同。以下为一条read信息的示例：

原始下机数据包含建库时引进的接头序列以及质量过低的碱基，这些因素会导致后续比对到基因组的reads较少，从而导致得到的信息较少，因此需要进行过滤。利用trim_galore软件对原始数据进行去除接头序列及低质量碱基等质控步骤。

（二）序列比对

经过质控的reads需要根据与参考基因组的序列相似度比对到参考基因组上。相比于常规基因组及转录组测序，WGBS测序方法产生的数据的特点决定其在比对时存在三大困难：

（1）DNA片段正链和负链经过重亚硫酸盐转化后将不再反向互补，再经过PCR，便会产生四条不同的序列，这将大大增加比对时的计算量。

（2）经过重亚硫酸盐转化后，DNA序列大部分C碱基被转化成T碱基，因此序列含大量T而缺乏C；经过PCR后，产生的互补链则含有大量A而缺乏G。这样便导致序列的复杂度降低（即序列的组成特征更单一），从而增加比对的难度。

（3）C和T的比对是不对称的。经过重亚硫酸盐转化后，序列中非甲基化的C碱基（占大部分）被转化为T，这将导致测序序列与参考基因组不匹配，T既可能应该比对到T上，有可能应该比对到C上；而C则只能比对到C上。这也增加了比对的难度。

利用BSMAP软件进行比对。BSMAP进行比对时，先以参考基因组上C碱基的位置作为指导，将reads中对应参考基因组C碱基位置的T标记为C，其他T保持不变，从而使reads可以直接比对到参考基因组。

（三）甲基化水平计算

甲基化水平可根据未转化为 T 的 C 与转化为 T 的 C 的 reads 的比例计算得到，即：

Beta-value = C-reads / (C-reads + T-reads) 100%

其中，Beta-value 即为该胞嘧啶的甲基化水平，C-reads 为覆盖该位点的支持甲基化的reads 数目（测得该位点为 C 的 reads），T-reads 为覆盖该位点的不支持甲基化的 reads 数目（测得该位点为 T 的 reads）。 计算原理示意图如下：

利用BSMAP统计甲基化水平。

（四）差异甲基化区域（DMR）鉴定及统计

DMR检测使用权威期刊发表的metilene软件。该软件先将基因组进行预分段，以排除较长序列中不包含CG位点的片段。随后，利用二元分隔算法，递归缩小检测范围，以搜索得到组间累积平均甲基化差异最大的区域，作为可能的DMR；最后，结合双重统计学检验（MWU-test和2D KS-test），得到准确的DMR。检测原理如下图所示：

本分析检测DMR的标准如下：

（1）区域平均甲基化差异不小于01；

（2）CpG位点数不少于5个；

（3）区域长度不小于50 bp；

（4）甲基化水平差异统计检验的校正P值小于005；

（5）2D KS-test检验P值小于005。

（五）信息分析流程示意图

DNA甲基化组学研究的核心内容在于对DNA甲基化数据的挖掘。DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。

首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。

其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。

最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。

Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究

1、背景

小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。

2、方法

利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究

3、结论

全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。

以上就是关于全基因组甲基化测序实验流程和分析思路的介绍。

参考文献：

[1] Ashburner, M and C A Ball, et al Gene ontology: tool for the unification of biology The Gene Ontology Consortium Nat Genet, 2000, 25 (1): 25-9

[2] Dirk Schübeler Function and information content of DNA methylation Nature, 2015, 517: 321–326

[3] Frank Jühling et al metilene: Fast and sensitive calling of differentially methylated regions from bisulfite sequencing data Genome Research, 2016, 26: 256-262

[4] Kanehisa M, Goto S KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes Nucleic acids research, 2000,28(1): 27-30

[5] Tadafumi Kato Kazuya Iwamoto Comprehensive DNA methylation and hydroxymethylation analysis in the human brain and its implication in mental disorders Neuropharmacology, 2014, 80: 133-139

[6] Xiaojing Yang et al Gene Body Methylation Can Alter Gene Expression and Is a Therapeutic Target in Cancer Cancer Cell 26, 577–590

[7] Yuanxin Xi et al BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program BMC Bioinformatics, 2009, 10:232

[8] Gao F, et al De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis Cell Res 2017 Apr;27(4):526-539 pii: cr201725

优点是合成周期短，可以保证序列的100%正确无误，基因合成具有更大的灵活性，可以对基因的酶切位点和基因序列进行修改，方便下游的克隆和实验，研究人员根据自己的意愿设计得到自然界中很难获得甚至不存在的基因，基因合成的基因可以进行密码子优化，使基因在各种生物表达体系中都能得到良好表达。缺点是有风险导致产生致癌物。简称UDS。发生于正常DNA复制合成主要周期S期以外的合成。真核细胞生长周期中DNA正常复制合成的主要时期是S期，当外源因素导致DNA损伤时，有发生于S期以外的DNA修复合成。

科学最大的奥秘之一莫过于DNA序列，这是一个非常复杂的代码。它具有独特的双螺旋形状，就像扭曲的阶梯一样，在地球上任何生物体内都可以发现它的存在，并携带独特的遗传密码。

在地球上，人类基因组含有大约32亿个DNA碱基对，其他生物则具有不同的基因组大小。DNA可以说是组合成地球上任何生物的蓝图或者说配方。

但是问题来了，DNA是一个程序，是一个非常精确的数字程序，这就引发了一个问题，编写这个程序的人是谁有科学家称人类dna被 外星人 设计，并将遗传信息存储到NDA当中。

dna的发现

1869年，年轻的瑞士医生弗雷德里希·米歇尔首先从白血球的细胞核中，分离出一种被他称为“核素”(nuclein，现称核酸)的化学物质，他注意到这种物质具有非常奇特的特性，他也是最早注意到DNA存在的人。

但人类科学家们真正开始了解DNA还得从1953年开始说起，当时的有着美国分子生物学家、遗传学家和动物学家称号的詹姆斯·杜威·沃森和英国分子生物学家弗朗西斯·克里克一同向世界宣布了他们发现了DNA，并揭示了DNA的结构和特性，并称DNA是携带我们遗传信息的分子。

他们发现人类的蓝图被封装在一串长长的核酸中，排列成双螺旋结构。因为这一发现，他们连同莫里斯·威尔金斯，在1962年被授予诺贝尔生理学和医学奖。

不过，虽然此项发现意义重大，但仍然无法解答，DNA是如何将信息转化为蛋白质的。而且研究至今，科学家们对DNA的了解仍然一知半解，许多答案更是得不到解答。

到底，DNA到底是谁设计的，于是有科学家将猜想放大到了 宇宙 中的其他生命，也就是外星人。

人类dna被外星人设计

在《生命本身:起源和本质》一书中，作者弗朗西斯·克里克说过，DNA分子绝对不可能就这么在地球上产生，它必定来自其他地方。

这也让许多人更加肯定了人类DNA来自外星生命的可能性，而一个耗时13年，致力于研究人类基因的组织费先科夫天文物理研究中心也发现了新的证据。

他们称人类是被更高等的生命或者说力量设计出来的，在人类的DNA当中有一套计算模式以及编程预言。并且在人类DNA中，有97%的非编码序列，它们其实是来自宇宙中高等外星生命体创造的。

不仅是他们，连发现DNA分子结构的人都说过，人类的DNA是其他行星上的高等智慧生命刻意送到地球的，地球上的生命有很大可能性这样产生，但目前没有足够的科学证据。

神秘的DNA垃圾

另外，根据远古外星人理论，在很久以前，外星人造访了地球，并给地球上的生命“编程”，而我们就称为了程序设定的“人类”。很可能我们的DNA中就隐藏了被 *** 控进化的答案，但我们无法解答。

根据遗传学家的证实，只需要5%的人类DNA就能克隆出一个人，所以也有专家称我们体内95%的遗传物质是DNA垃圾。因为它们现在已经没有作用，或者说是以前被用过，现在被遗弃了，我们的阑尾就是一个很好的例子。

DNA垃圾是否包含了人类进化的秘密这需要人类完全解码DNA才能揭开。这是不是外星人在人类进程中扮演重要角色的证据呢

科学家们发现DNA的存储能力是世界上任何一台电脑和硬盘都比不上的，假设你是外星人，你想存放一些智慧信息，将它们永远的留存下来，你会在硬盘上存储，还是会在人类的dna上呢答案毋庸置疑。

纵观人类发展史，短短的不到万年的时间就从原始时代迈进了太空时代，人类智慧和文明的快速发展，好像都很合理，但是当你看到猩猩会用电脑时你是什么感觉

无论事实如何，毫无疑问，我们的DNA是惊人的，我们独特的遗传密码引发了许多关于我们在宇宙中的存在和角色的问题。

ABO血型鉴定的原理是根据红细胞上有或无A抗原或/和B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型四种。可利用红细胞凝集试验，通过正（血清试验）反（细胞试验）定型准确鉴定ABO血型。所谓正定型是用已知抗A和抗B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或/和B抗原，所谓反定型是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗A或抗B。 亲代：A型+A型 ，子代可能：A型、O型 ，子代不可能：B型、AB型

亲代：B型+A型，子代可能：A型、B型、AB型、O型，子代不可能：无

亲代：B型+B型 ，子代可能：B型、O型，子代不可能：A型、AB型

亲代：一方或双方是AB型，子代可能：A型、B型、AB型，子代不可能：O型

亲代：A型+O型，子代可能：A型、O型 ，子代不可能：B型、AB型

亲代：B型+O型，子代可能：B型、O型 ，子代不可能：A型、AB型

亲代：O型+O型，子代可能：O型 ，子代不可能：A型、B型、AB型

注释：血型鉴定不能作为是否具有亲缘关系的标准，只有DNA亲子鉴定，才是确定是否具有亲缘关系的黄金标准。

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1DNA的结果应该已经出来了一般十天 医院就会把你的DNA鉴定报告结果寄到出入境你的经办民警那样了

2DNA出了结果以后要等上报省厅划线公布

3今年之内是肯定的 一般情况下做完DNA三个月左右就可以拿到了

首先你是哪个省的

其次申请你的父亲或者母亲是不是永久居民？如果是 那么还需要等香港入境处发来的入境处签发的许可证 不然没有许可证 即使单程证出来你也过不了香港海关

按照正常到底来说你应该拿到单程证了 我觉得其中应该有问题了

DNA受损后，发生在正常复制合成期（S期）以外DNA的修复合成，称为程序外DNA合成（UDS）或DNA修复合成。

DNA修复

光修复

这是最早发现的DNA修复方式。修复是由细菌中的DNA光解酶（photolyase）完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300-600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中，人体细胞中也有发现。DNA光解酶可被可见光（300－600纳米，400纳米最有效）激活，分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。此酶广泛存在，但人体只存在于淋巴细胞和皮肤成纤维细胞，且是次要修复方式。

切除修复

（一）细胞内有多种特异的核酸内切酶，可识别DNA的损伤部位，在其附近将DNA单链切开，再由外切酶将损伤链切除，由聚合酶以完整链为模板进行修复合成，最后有连接酶封口。 （二）碱基脱氨形成的尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤可被专一的N-糖苷酶切除，然后用AP（apurinic/apyrimidinic，缺嘌呤或缺嘧啶）核酸内切酶打开磷酸二酯键，进行切除修复。DNA合成时消耗NADPH合成胸腺嘧啶，可与胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶相区别，提高复制的忠实性。RNA是不修复的，所以采用“廉价”的尿嘧啶。 （三）切除修复不需光照，也称暗修复。大肠杆菌中有UvrABC系统，可切除修复嘧啶二聚体。人体缺乏相应系统则发生“着色性干皮病”，皮肤干燥，有色素沉着，易患皮肤癌。可加入T4内切酶治疗。

单链断裂的重接

DNA单链断裂是常见的损伤，其中一部分可仅由DNA连接酶（ligase）参与而完全修复。此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在，修复反应容易进行。但双链断裂缺几乎不能修复。

碱基的直接插入

DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶（insertase）识别结合，在K+存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键，且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，使DNA完全恢复。

烷基的转移

在细胞中发现有一种O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶，能直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。这个酶的修复能力并不很强，但在低剂量烷化剂作用下能诱导出此酶的修复活性。

重组修复

此过程也叫复制后修复。重组修复中原损伤没有除去，但若干代后可逐渐稀释，消除其影响。所需要的酶包括与重组及修复合成有关的酶，如重组蛋白A、B、C及DNA聚合酶、连接酶等。

诱导修复

DNA严重损伤能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应，包括修复效应、诱变效应、分裂抑制及溶原菌释放噬菌体等。细胞癌变也可能与应急反应有关。应急反应诱导切除和重组修复酶系，还诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，加快修复，避免死亡，但提高了变异率。单链DNA诱导重组蛋白A，可水解Lex A蛋白，使一系列基因得到表达，如RecA、UvrABC、SOS修复所需的酶等，产生应急反应。应急反应可作为致癌物的简易检测方法。采用缺乏修复系统、膜透性高的Ecoli突变株，并添加鼠肝匀浆液。

Ada蛋白

也叫适应性蛋白，可识别甲基化的DNA，将甲基转移到自身的半胱氨酸上，不可逆，故称“自杀修复”。可修复磷酸及鸟苷上的甲基。

真核细胞修复特点

1 多聚腺苷酸－核糖化：由多聚(ADP-核糖)聚合酶催化，用NAD合成并转移到相应蛋白上。可增加一些修复酶的活性，如连接酶。 2 转录－修复偶联：转录时，若模板链损伤，则转录暂停，转录因子TFIIS使聚合酶退回，CSA/CSB及TFIIE召集修复。若DNA双链损伤，则模板链优先修复。

Ecoli中存在4种基本的DNA修复系统

直接修复（direct repair），核苷酸切除修复（excision repair）、碱基切除修复（base excision repair）和错配修复（mismatch repair）。

直接修复（direct repair）

是通过一种可连续扫描DNA，识别出损伤部位的蛋白质，将损伤部位直接修复的方法。该修复方法不用切断DNA或切除碱基。 一些蛋白质可以识别和修复某种损伤的核苷酸和错配的碱基，这些蛋白可以连续监测DNA。胸腺嘧啶二聚体就可以通过直接修复机制修复。胸腺嘧啶二聚体是紫外线辐射造成的。在所有原核生物和真核生物中都存在一种光激活酶（photoreactivating enzyme），在可见光存在下，这种酶可以结合胸腺嘧啶二聚体引起的扭曲双螺旋部位，催化两个胸腺嘧啶碱基再生，正常的A-T碱基对重新形成，然后光复活酶从已修复好的DNA上脱落。

核苷酸切除修复（excision repair）

通过切除-修复内切酶使DNA损伤消除的修复方法。一般是切除损伤区，然后在DNA聚合酶的作用下，以露出的单链为模板合成新的互补链，最后用连接酶将缺口连接起来。 形成胸腺嘧啶二聚体会引起DNA双螺旋结构的变形，这样的损伤也可以通过核苷酸切除系统修复。修复系统中的主要酶ABC切除核酸酶。给出了ABC切除核酸酶修复DNA损伤的过程。首先ABC切除核酸酶从损伤部位的两侧切去含有损伤的DNA链。然后，解旋酶除去内切酶切点之间的DNA片段，有时DNA片段由外切酶降解，产生单链缺口。然后在DNA聚合酶的催化下按照互补链填充缺口，切口最后通过DNA连接酶连接。

碱基切除修复DNA

糖基化酶（DNA glycosylases）能识别DNA中的不正确碱基，如尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤，这些碱基是由胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤脱氨形成的。DNA糖基化酶可以切断这种碱基N-糖苷键，将其除去，形成的脱嘌呤或脱嘧啶部位通常称为"abasic"部位或AP位点。然后由AP内切核酸酶（AP endonucleases）切去含有AP位点的脱氧核糖-5-磷酸，在DNA聚合酶作用下重新放置一个正确的核苷酸，最后通过DNA连接酶将切口封闭。每种DNA糖基化酶通常对一种类型的碱基损伤特异。

错配修复（mismatch repair）

在含有错配碱基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢复的修复方式。这种修复方式的过程是：识别出下正确地链，切除掉不正确链的部分，然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用，合成正确配对的双链DNA。 错误的DNA复制会导致新合成的链与模板链之间的产生错误的碱基配对。这样的错误可以通过Ecoli中的3个蛋白质（MutS、MutH和MutL）校正。该修复系统只校正新合成的DNA，因为新合成DNA链的GATC序列中的A（腺苷酸残基）开始未被甲基化。GATC中A甲基化与否常用来区别新合成的链（未甲基化）和模板链（甲基化）。这一区别很重要，因为修复酶需要识别两个核苷酸残基中的哪一个是错配的，否则如果将正确的核苷酸除去就会导致突变。(右图)说明了MutS、MutH和MutL三种蛋白质是如何校正新合成DNA中的一个错配错误的。未甲基化的GATC序列不需要紧靠着错配碱基，因为错配碱基与GATC序列之间的间隔的DNA序列可以被外切核酸酶切除，是从3ˊ还是从5ˊ方向切除取决于不正确碱基的相对位置。

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