帝国时代3无法定位程序输入点，怎么办！！~~游民星空下载的。

无法定位dll输入点是常见的问题，原因是没有安装 vc2010

1、首先确定你的granny2DLL文件已经放到正确的文件夹下

2、去搜一下：vc2010,下载装上就好了

注意：有很多人说安装了VC2010也没用，那肯定是因为VC2010只是解压缩了，并没有点解压后的文件夹里的setup安装

亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)

直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化此方法一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态在寻找有意义的关键性CpG位点上,有其他方法无法比拟的优点测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列它的不足是耗费时间和耗资过多,至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据,需要大量的克隆及质粒提取测序,过程较为繁琐、昂贵

第一部分 基因组DNA的提取

这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以DNA比较稳定,只要在 *** 作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的

此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者

使用两者的细节：

1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；

2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了两者均于-20度保存

验证提取DNA的纯度的方法有二：

1：紫外分光光度计计算OD比值；

2：1%-15%的琼脂糖凝胶电泳

我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰

第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

如不特别指出,所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌

1：将约2ugDNA于15mlEP管中使用DDW稀释至50ul；

2：加55ul新鲜配制的3M NaOH；

3： 42℃水浴30min；

水浴期间配制：

4：10mM对苯二酚（氢醌）,加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡**）

5： 36M亚硫酸氢钠（Sigma,S9000）,配制方法：188g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 50,最终体积为5ml这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心PH一定要准确为50加520ul至上述水浴后溶液中

6：EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液

7：加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化

8：50℃避光水浴16h

一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适

这一步细节：

1：基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug

2：所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确

3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制50,否则PH不合适会影响后续纯化吸收

4：水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全

第三部分 修饰后DNA纯化回收

EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的

1 将移液器q头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净15mlEP管中

2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega,A7280）

1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；

2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合；

3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便；如果没有,需要自备3ml-5ml注射器将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积

4）将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2ml 80％的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出此为洗涤步骤

5）将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净15ml洁净EP管上,离心12000rpm,2min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态

6）将小柱取下置于另一洁净15mlEP管上,移液器加50ul预热好的DDW,室温放置5min

7）离心12000rpm,20s,此为洗脱步骤,此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液,终体积为50ul

3：加55ul 新鲜配制的3M NaOH,室温放置15min

4：加33ul 10M乙酸铵,以中和NaOH,使溶液PH于70左右

5：加4ul 10mg/ml糖原,此作为沉淀指示剂,因为其与乙醇混合后可产生沉淀,便于以后离心后辨别回收物的位置,以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走其实,加入这些糖原究竟能起多大作用,不好说不过有国产糖原卖,包装不大,也很便宜,买来一用,算严格遵守文献的步骤吧

6：加270ul 冰无水乙醇,置于-20度,过夜沉淀有人为沉淀最短可至2小时,但我认为时间长些可能会更好并且做到此步骤时,一般会到中午,如果样本多的话要到下午,不妨放置过夜,日程可以轻松些,顺便做些其他试验如果想当天做完,没有问题,但我认为最好多沉淀些时候,至少6小时吧（这是经验,我做过最少6小时,也是可以的,再短就不敢发表意见了）

7：4度,12000rpm离心,30min,倒去上清液,收集沉淀不必吸净

8：加500ul 70%乙醇,不要将沉淀吹打起来,只要把乙醇加上即可轻柔倾斜EP管,旋转一圈,再次离心,4度12000rpm,5min离心后倒掉上清,再加同量乙醇,同样再做一遍此为洗涤步骤,共2次

9：倒掉上清,并常温简短离心后,将附壁乙醇离至EP管底,移液器小心将残余液体吸净,室温干燥5min,或沉淀由不透明变为半透明或透明时,加入20ul- 30ulDDW,溶解沉淀至此,已完成了修饰后DNA的纯化回收,所得为修饰后DNA溶液,可用于此后的进一步实验

10：-20℃保存DNA溶液

此步细节：

1：在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用

2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出

3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便

此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了

第四部分 修饰后DNA用于PCR

这一步也没有悬念我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：

1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度,我曾设计过几对引物,并且试验了一下,但以失败告终如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多,自己设计引物没有问题如果不是这样,还是参考文献更好些首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,更好了,可以直接联系咨询查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别然后再到google上搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强我也是按此行事,算比较顺利

2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum）,但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶是可以的我开始使用的是Takara的LA Taq,很好用,配有10x含mg++的LA缓冲液有时候用没了,暂时以Takara 的普通Taq酶也可以如何选择,可以根据自己的情况初作者还是用好一点的酶

3：PCR的条件：变性一般都选择95度,3min其余我感觉还是根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试一般和文献报道差别不大只是扩增片断特异性的问题建议根据文献

4：做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行

5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙,我认为会影响温度的传递

这一部分有些啰嗦,只是个人一些不成熟经验有疑问处,请大家指出,交流今天先到这里,现写一些内容,比较费劲,总是不能一挥而就望见谅歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分

第五部分 PCR产物的凝胶回收

这一步比较简单,可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒,国产的就很好、价格也合理,比如TIANGEN的产品（用过）把切下来的胶按说明书 *** 作即可

几个细节：

1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液凝胶浓度1%-2%均可

2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性

3：紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤

4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的

第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选

1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）

15ul体系

T-easy 1ul

Ligase 1ul

2xbuffer 75ul

DNA 55ul

4度,过夜

2：连接产物的转化

1）-70度冰箱内取出感受态细菌,融化后置于冰上；

2）连接产物15ul 全部加入,至于冰上30分钟；

3）42度, 90秒钟；

4）冰上2分钟；

5）800ul LB培养基；

6）280rpm,37度,摇床45分钟（将管放水平了摇,保证菌液摇匀）；

7）8000rpm,1分钟；在超净台内去上清,留100-150ul；

8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）

先涂：X-gar 35ul

IPTG 25ul

后涂：混悬液

过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点,取白色斑点,尤其是蓝色斑点周围的白色斑点,此处自联率较低

3：取白斑,划种于新板上

新板：先涂：X-gar 35ul

IPTG 25ul

然后于板底划出分区,进行标记根据需要,一般一板作50个克隆没有问题

针头挑白斑划2道于板上相应区域内

37度,孵箱过夜

4：联系测序公司送测序一般一个克隆在35-45元

这一部分的细节：

1：涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；

2：不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个

CPG SUPPLY CHAINSupply chain,供应链是通过前馈的物流和反馈的信息流把包括原材料供应商、产品制造商、分销商和客户等部分连接起来的系统

供应链是可以被从地理概念上理解的分布式的一些公司，在这些公司里原材料、中间产品或者最终产品可以被获得、加工、储存、销售和运输，他们通过产品的流动被连接

起来。

企业从原材料和零部件采购、运输、加工制造、分销直至最终送到顾客手中的这一过程被看成是一个环环 相扣的链条，这就是供应链。供应链的概念是从扩大的生产（Extended Production）概念发展来的，它将企业 的生产活动进行了前伸和后延。譬如，日本丰田公司的精益协作方式中就将供应商的活动视为生产活动的有机 组成部分而加以控制和协调。这就是向前延伸。后延是指将生产活动延伸至产品的销售和服务阶段。因此，供 应链就是通过计划（Plan）、获得（Obtain）、存储（Store）、分销（istribute）、服务（Serve）等这样 一些活动而在顾客和供应商之间形成的一种衔接（Interface）， 从而使企业能满足内外部顾客的需求。供应 链与市场学中销售渠道的概念有联系也有区别。供应链包括产品到达顾客手中之前所有参与供应、生产、分配 和销售的公司和企业，因此其定义涵盖了销售渠道的概念。供应链对上游的供应者（供应活动）、中间的生产 者（制造活动）和运输商（储存运输活动）、以及下游的消费者（分销活动）同样重视。

广泛的应用支持，可以扩展数据仓库和ERP系统的价值，建立对电子商务、CRM、金融、制造业、零售和CPG（consumerpackagedgoods）等应用的分析程序。

这说明你这个游戏在运行过程中出现了问题，估计是你安装游戏的程序有问题，建议你去网上重新下载一个来安装。

帝国时代（英文版）+汉化补丁

软件大小：37 MB

软件语言：简体中文

软件类别：电脑游戏 / 免费版 / 即时战略

运行环境：Win9x, NT, 2000, XP, 2003

会员级别：匿名用户

软件简介：

Age Of Empire

解压后运行“帝国时代exe”进行安装。如需汉化，把同目录下的languagedll拷贝到安装目录下，替换同名文件即可。

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这个是个木马下载者，可以给你的电脑里面下载木马，病毒

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凡是出力轴径为18、22、28mm的CPG减速机标准出厂均无油孔；出力轴径为32、40、50mm的CPG齿轮减速机标准出厂均开油孔，台机减速机工厂所出齿轮减速马达一律开油孔，故凡是开油孔的CPG减速机订货前客户须确认好安装方式才可开油孔，以防漏油，而不开油孔可多种安装方式。

根据CPG产品的设计：出厂前已添加润滑油脂（BT-860-0），在正常条件下运转20,000小时可不必更换润滑油脂；但在特殊环境条件下运转时，如高温、长时间运转、冲击负荷等，则换油频率为10,000~15,000小时。

出力轴径为18、22、28mm的齿轮减速马达一般功率为100W~400W，重量相对较轻，负载力也相对较轻，内部所产生的热量相对较少，本身为铝壳材质的机身就能达到较好的散热效果。

且不开油孔的减速马达客户可以根据需要改变安装方式也不存在漏油的问题，无油孔也使得减速马达密封性能更好，减少灰尘的入侵，有油孔的话需要定期清理油塞、油帽以免油孔堵塞造成减速马达的故障。

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