简述ELISA法在免疫室的应用

我是从事食品安全检测elisa的工程师，这个问题是要打好多的字才能解释清楚，我尽力吧，希望能采纳：

1我们常用的食品安全检测elisa原理有直接法、间接法（一步法、二步法）。对于使用哪种方法，是经过多次研发调试得出的，要考虑线性、变异、检测限等等。

2根据你说的应该是间接二步法，实验过程是：加标准品/样本——加一抗——反应——甩出、洗板——加酶标二抗——反应——甩出、洗板——加显色液——反应——加终止液——检测。

3第一个问题：看的是液体的颜色，颜色深含量少，颜色浅含量高，一般是用酶标仪，双波长检测。

4第二个问题：实验用的抗体分为单抗和多抗，通常将待检测物认为是抗原，如果直接使用酶标抗体对抗原进行检测，难以保证实验的检测限及控制变异，并且实验的可重复性不好，当然随着研发的推进，将来可能会有更加便捷的检测方法。

ELISA基本原理是抗原或抗体预先结合到某种固相载体表面;测定时，将待测样品(含待测抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物;反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量(免疫复合物)与待测标本中待检抗体或抗原的量呈一定比例;经洗涤去除反应液中其他物质，加入底物进行显色，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。

临床应用:①双抗体夹心法:用于检测抗原，适用于检测两个或两个以上抗原决定簇的多价抗原;②间接法:用于检测抗体;③竞争法:用于小分子抗原和半抗原的测定，也可以抗体进行测定;④捕获法:用于血清中某种抗体亚型成分(如IgM)的测定。

目前做多的方式是采用pH96的碳酸盐缓冲液包被，4℃过夜包被或者37℃包被2h，包被的最适浓度随固相载体和包被物的性质变化，一般蛋白质的包被浓度为1-5ug/ml，要明确针对特定包被抗原的最适包被浓度需要通过实验来确定。

封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的， *** 作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。而在间接法测定中，封闭一般是必不可少的。

常用的封闭剂有005%-05%的BSA、10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉，AbMART推荐使用5%脱脂奶粉，价廉而且封闭能力强，不过5%脱脂奶粉只适合短期内使用，不宜长期保存，所以试剂盒中较少使用

本产品是用于伏马菌素定量分析的酶联免疫(ELISA)试剂盒

试剂盒包含96孔或48孔测试所需的材料，包括标准品，需要实验室配备酶标仪

检测范围: 谷物

样品前处理: 研磨, 甲醇水提取, 过滤, 稀释

检测时间:  20分钟 (不包括样品前处理时间)

检出限 谷物和饲料: 075 ppm

特异性

组分交叉反应率 %

Fumonisin B1

Fumonisin B2

Fumonisin B3

100

124±11

100±10

1检测原理

该测定在已用抗伏马菌素抗体包被的微孔中进行。 在预混孔中，将酶标记的伏马菌素和标准溶液或样品混合，然后转移到包被有抗伏马菌素抗体的微孔板中。在孵育过程中，游离的伏马菌素和酶标记的伏马菌素 竞争固相上的抗伏马菌素抗体结合位点。然后在洗涤步骤中除去任何未结合的酶耦合物和伏马菌素分子。通过添加固定量的底物，将无色的色原体转化为蓝色 产物。添加终止试剂会导致颜色从蓝色变为**。用酶标仪在450nm处测量吸光度。溶液颜色的深浅与标准品/样品中的伏马菌素浓度成反比。

2提供的试剂

提供的试剂

预混合孔板：未经包被的空白孔。终止液: 1瓶，白色盖子。

伏马菌素B1标准品：5瓶，浓度分别为：0ppm, 075ppm, 4ppm, 20ppm, 60 ppm酶耦合物：1瓶。

洗涤缓冲液10x: 1 瓶, 50ml。发展液: 1瓶。

洗涤缓冲液10x: 1 瓶, 50ml。发展液: 1瓶。

微孔板：包被有抗伏马菌素抗体,装于带有干燥剂的铝箔袋中。（微孔板可独立拆分，单独使用。）

3未提供的试剂及设备

未提供的试剂及设备

霉菌毒素提取液 A或 70% 甲醇甲醇

NaCl去离子水或蒸馏水。

天平粉碎机或研磨机 (例如 “Osterizer”)

振荡器（可选）滤纸 (Whatman 1)

20~200 ul 可调微量移液器50~300 ul 多通道可调微量移液器 (可选)

吸水纸酶标仪（450nm）

4使用者注意事项

① 该产品仅供体外诊断使用。

②部分试剂含有防腐剂。终止液含有硫酸并且有刺激性； 标准品中包含甲醇而易燃，小心处理试剂，避免接触皮肤、眼睛和黏膜。

5处理和存储说明

①将试剂盒存储在 2 ~ 8℃，不能冷冻 ②将未使用的微孔板放回到装有干燥剂的铝箔袋中 ③不要使用过期的产品 ④不要混合不同试剂盒内的试剂 ⑤严格按照试剂盒内附带的说明书进行 *** 作

6样品处理

①充分混匀待测样品

②细细粉碎样品 

③称取粉碎后的样品，选择下表中描述的任一选项

样品量NaCl提取溶液

50 g10 g250 ml 70% 甲醇

5 g1 g25 ml 70% 甲醇

50 g/250 ml 70% 甲醇, 4% NaCl

5 g/25ml 70% 甲醇, 4% NaCl

7分析过程

71实验前准备工作

（1）使用前将所有试剂置于室温，并在室温下保持至少1小时

（2）使用后立即将剩余试剂放于 2 ~ 8 ℃ 环境中

（3）不要更改实验步骤，特别是：

①不要延长第一步的孵育时间；

②不要在高于25℃和低于18℃的环境中孵育微孔板；

③孵育期间不要摇动微孔板；

④使用精确的微量移液器和配套q头

(4)一旦开始实验，应不间断的完成所有实验步骤

(5)ELISA结果的可重复性在很大程度上取决于洗涤微孔板的效率和均匀性；始终遵循说明书中的所述程 序；

(6)每个标准品和样品使用新的一次性吸头，以避免交叉污染

(7)不要让吸头接触微孔中已有的液体

(8) 在所有孵育期间避免阳光直射 。不能使用密封胶带覆盖微量滴定板

72分析步骤

(1)预先安排好实验流程，记录好每个标准品/样品的位置，如果条件允许，建议做平行实验。把未使用的微孔条放回到装有干燥剂的铝箔袋中。同时准备相同数量的空白预混合孔。注意：建议在每次测定中不超过48孔（包括标准品）；如果不使用多道移液器，则建议在每次测定不超过16孔（包括标准品）

(2)添加 100 µl 酶耦合物到每个预混合孔中

(3)添加 50 µl 标准品/样品到相应的预混合孔中

①使用微量移液q，混合每个预混合孔的内容物（移液器上下三次），立即将100 µl转移到相应的抗伏马菌素抗体包被的微孔中。

②注意：每次使用新的加样头，防止交叉污染

(4)室温孵育 10 分钟；

不要延长第一步的孵育时间，在孵育过程中不要摇动微孔板

(5)洗板

①孵育结束后倒掉孔中的液体

②用稀释后的洗涤缓冲液填满微孔，倒掉微孔中的液体 重复清洗步骤三次

③将微孔板倒扣在吸水纸上并轻轻敲打，清除残留的液滴

不要让微孔变干

(6)发展：添加 100 µl 发展液到每个微孔中，彻底混合几秒钟

(7)室温孵育 10 分钟

(8)添加50 µl 终止液到每个微孔中，并彻底混合几秒钟

(9)在 450 nm处测定吸光度值，在15分钟内读数

8结果计算

将每个标准品和样品的吸光度值除以标准0（B0）的吸光度并乘以100；因此，最大结合（B0）等于100％，吸光度值以百分比表示

①根据每个标准品的B/B0值和伏马菌素标准品浓度绘制标准曲线

②将每个样品的B/B0值插入校准曲线中得到相应浓度

9标准曲线绘制

10结果评估

在结果出具之后，有必要验证测定性能。通过将获得的数据与试剂盒中给出的数据进行比较来执行验证。 如果值超出给定的数据，建议检查试剂盒的失效日期，吸光度记录的波长以及所用的程序。 如果没有出现 *** 作错误，请联系我们的技术支持

11试剂盒参数

111分析参数

Bo 吸光度值≥ 07 OD450nm

B/Bo 50%23 - 56 ppm

112分析性能

LOQ玉米：1 ppm

12责任

使用试剂盒评估为阳性的样品必须使用确认方法重新测试。钟鼎生物对由于不正确使用该试剂盒而导致的任何客户损失以及因结果而采取的任何行动不承担任何责任。

钟鼎生物官网

给你提供一份进口的ELISA定量检测人血清中IL-6的说明书：

人IL-6 ELISA

原理：

本试剂盒采用双抗夹心ELISA法。抗人IL-6单抗包被于酶标板上，人标本中的IL-6会与单抗结合。加入生物素化的抗人IL-6（二抗），它将与结合在单抗上的人IL-6结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin 将与二抗的生物素结合，多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。人IL-6的浓度与OD(450nm)成正比。

试剂盒组成：

酶标板(Coated Wells) 48wells Anti-human IL-6 Biotin 1 vial

浓缩洗涤液(100X)(Washing Concentrate) 5ml 标准品(Standards) 1 vial

显色液(TMB Substrate) 6ml 标准品稀释液(Standard Diluent) 7ml

终止液(Stop Solution) 6ml 浓缩酶联物（HRP） 1 vial

酶联物稀释液(HRP Diluent) 7ml 生物素稀释液(Biotin Diluent) 7ml

注意事项:

1 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入HRP或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6 在储存和温育时避免强光直接照射。

7 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9 不能使用过期产品。

10 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

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