Ion Torrent 基因分析仪——介绍及原理

IonTorrent基因分析仪组件：

IonTorrent与Illumina原理的主要区别：

Illumina：荧光信号

Ion Torrent：电信号

IonTorrent 核心理念：

核心理念：芯片就是测序仪

特点：扩展性、简捷、快速

半导体测序技术：

IonTorrent生物化学原理：

IonTorrent如何快速、直接检测：

Ion系列测序平台适用的chips及数据产出情况汇总：

PGM Chip：

314 Chip：1.2M Wells

316 Chip：6.1M Wells

318 Chip：11M Wells

Ion torrent测序过程：

Follow 和Cycle的含义：

一个“Follow”：将一个特定的dNTP(T, A, C, or G)打入芯片，随后进行洗脱；

一个“Cycle”：是由4个dNTP组成，例如：A-T-C-G= 1 Cycle。

测序时“Follow”的顺序是怎样的？

“Flow”的顺序是以下dNTP顺序的重复（参数可调）：

“TACG-TACG-TCTG-AGCA-TCGA-TCGA-TGTA-CAGC”

IonTorrent 测序记录“Ionograms”：

An “ionogram”代表信号的输出

必须“从上到下”和“从左向右”读

柱的高度代表在一个“Flow”中有几个核酸结合上去

“Negative ” 或 “zero” flows 代表没有核酸结合上去

IonTorrent实验流程汇总：

IonTorrent特点：

1.扩展性   :灵活高效的Ion Torrent

2.简捷：简单而又真实的生物化学原理

3.快速：最快速的 *** 作流程

IonTorrent应用与产品化：

提供快速鉴别与筛查食源性致病菌的整套工具

微生物全基因组测序— de novo 测序和重测序；

宏基因组测序（16S/18S…）—一项有效的工具；

RNA病毒测序：

1.纯化的RNA病毒分型

–病毒RNA抽提

–长PCR扩增子

–短PCR扩增子(利用AmpliSeq技术)

–TargetSeq捕获

2.未知的RNA病毒 denovo分析

–病毒RNA抽提

–反向富集，去除rRNA专有引物设计，去除宿主rRNA

Ion Total RNA-SeqKit (48 reactions)

•构建全外显子或Small RNA文库；

•维持原始单链并减少偏向性和错误；

•低起始量建库：总RNA 200ng或5ngmiRNA。

目标区域：

1.扩增子测序

基于PCR目标序列的深度测序，用于检测变异}扩增子的长度是可变的，

Ion Xpress™ 文库制备试剂盒与现有的Sanger测序法的引物完全兼容

利用barcoding试剂盒（条码试剂盒），可以实现多种样品的扩增子同时测序

检测生殖细胞和体细胞的突变

2.捕获目标序列 (目标序列>100kb)

通过杂交法或大量并行的PCR，实现目标序列的富集

•TargetSeq™定制富集试剂盒，可根据客户应用需求实现特定序列的富集

•可与其他富集方法兼容

Ion DNA 条码接头（Barcode Adaptor ）1-96试剂盒

1.Ion半导体测序技术采用优化的barcodes可以 一次进行多达96种文库的同时测序。

2.支持多种文库的目标序列或全基因组的再测序，可以降低成本，节省样品。

3. 最少的接头序列和强大的校正功能确保样品种类的确认

4. 兼容自动化 *** 作

微生物测序

准确，快速的细菌和病毒的从头测序和重测序

线粒体测序

多重线粒体测序用于科研，临床和法医等应用

扩增子测序

•多重扩增子测序用于快速的检测生殖细胞和体细胞的突变

•与毛细管电泳测序的引物完全兼容

•利用测序进行基因分型

•细菌和病毒的分型质粒测序

大片段目标序列（>100kb）的在测序

快速，简单的 *** 作流程适用于所有的大片段目标序列的富集方法

验证全基因组和显子组的突变

正交技术验证SOLiD®System/Illumina的全基因组和外显子组的测序结果

文库评估

在进行高通量的测序之前，对构建的文库进行快速的复杂性验证或QC质控

RNA测序

快速，简单的RNA测序解决方案（最初主要针对于小RNA&低复杂度的转录组）

IonTorrent数据处理：

Ion Torrent下机数据格式（SFF、BAM、Fastq）

默认下机文件类型为：BAM；

通过插件FastqCreator可下机直接生成：Fastq；

原始下机数据路径：

Fastq格式文件：/results/analysis/output/Home/（ReportName）/plugin_out/FileExporter_out.*

BAM格式文件：/results/analysis/output/Home/（ReportName）

IonTorrent测序质控：

Positive-controlKit，上机制备模板时加入；

可自行设置，占据上样量；

IonTorrent上机情况反馈

机器运行及分析的日志文件压缩包（Support文件）。

第二代测序技术又称为下一代测序（NGS），与第一代相比主要是1.高通量测序2.边合成边测序。

回顾二代测序的发展史

1996年Ronaghi和Uhlen发明了焦磷酸测序，454 Life sciences 公司基于此原理推出了测序系统Genome Sequencer 20System，标志着二代测序的商用；

2006和07年 Solexa和ABI公司推出了GA SOLID测序平台

2010年Life Technologies 推出Ion PGM系统

2014年华大推出了BGISEQ-1000

1.Illumina/Solexa测序平台

之前也总结过Illumina测序的原理，现简要梗概一下其步骤

1）DNA文库准备：先将DNA链打断成200-500bp的片段，末端修复后在两端连上特异性的接头

2）流动槽杂交：

带有接头的DNA片段流过流通池，与其上固定的种接头通过互补配对结合。这些固定的接头其后充当引物的作用，在聚合酶的作用下进行合成反应。

3）DNA合成后，变性使得未与流动池共价连接的DNA链解离并洗掉，反向练则以共价键结合在流动池的表面。因为DNA单链另一端也含有接头，能够和临近的接头互补，DNA链形成桥式结构，同样的这个相邻的接头充当引物，在DNA聚合酶的作用下， 合成双链桥式结构。重复此过程，形成5000-10000个copy。这个目的是形成序列相同的DNA簇，使得在测序的过程中产生足够强的信号。变性打开，各自形成单链的DNA链固定在表面。将反向链切除，将正向链的的3‘封闭，以免产生不必要的DNA延伸。

4）DNA测序：加入测序引物，DNA聚合酶，4种带不同荧光标记的dNTP，且这些dNTPde3’端羟基被封闭，无法继续下一个反应。计算机检测到荧光的信号后，将不同的信号转化为对应的碱基。加入化学试剂淬灭信号，并去除3’的保护基团，并进行下一个碱基的反应。

illumina测序一般能够检测150个碱基左右，因为在后续，由于DNA合成酶活力下降等原因，造成相同序列的DNA信号不一致，DNA测序的准确性下降。

在实际的测序过程中，通常一次性会测不同物种来源的DNA，此时，需要barcode来进行标记。不同的物种带有不同的barcode序列，在DNA测序完成后，需要加入barcode引物，将barcode也进行测序。

该测序系统基半导体测序原理，不需要进行光学感应。

原理简要概括如下：

在测序的过程中，识别不同的碱基不是依靠荧光信号，而是通过dNTP结合释放的H+。

更多的信息详见 7种测序平台 - Thinkando - 博客园 (cnblogs.com)

补充：

罗氏454测序

罗氏454的焦磷酸测序是最早发行的二代测序。其测序的文库的建立和Ion Torrent相似，一个磁珠吸附一个模板DNA，充当一个微型的反应器。外面裹以油，将不同的液滴隔离开来。不同的片段平行扩增，待反应结束后，破坏乳液，只剩下磁珠。此时一个磁珠=一条读长。

将磁珠放在PTP板中测序，依次加入ATCG四种碱基。让碱基能够成功配对时，会释放一个焦磷酸。

从本次课到第8次课，均是讲述DNA相关的知识。核酸的结构开始，到DNA如何组装为染色体，基因组学（5-6），DNA复制（7-8）。 学习该部分，希望同学们掌握描述DNA或是RNA时，常用的理化参数或者名词有哪些；还有就是关于核酸的常识。 当我们谈到核酸时，一般会关注GC含量、Tm值、大小（长度）。1). GC含量。 一个核酸分子中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率称为GC含量。在DNA中，GC含量愈高，DNA的密度也愈高；形成的双链愈稳定，因此热及碱不易使之变性。根据这一特性，可进行DNA的分离或测定。此外，对生物的基因组DNA来说，GC含量是一个固定值。2). Tm值。与此相关的是核酸的变性和复性。DNA在物理或化学因素作用下(如加热、酸碱或紫外线照射)，可以导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键(如磷酸二酯键、糖苷键等)则不受影响，称为DNA变性 (DNA denaturation or DNA melting)。凡能破坏双螺旋稳定的因素（如加热、极端的pH、有机试剂如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等)均可引起核酸分子变性。比如，PCR中，会使用90度以上的高温让DNA变性；分析RNA时，会用65度进行RNA的变性；Southern blotting中，会用0.4N的NaOH对凝胶中电泳分离的DNA进行变性。 Tm值，就是让一半的DNA分子发生变性时的温度。DNA的Tm值由以下几个因素决定：（1）GC含量，在一定条件下Tm高低与DNA分子中的GC含量成正比，G-C含量高时，Tm值比较高，反之则低。这是因为G-C之间的氢键较A-T多，解链时需要较多的能量之故。（2）DNA长度。DNA所处的溶液条件，影响因素包括离子浓度、pH值和有机溶剂。 DNA复性。复性（renaturation），也称退火（annealing），就是两条单链DNA分子之间依据Waston-crick碱基互补配对的规则，变成双链的过程。复性的最佳温度一般在比Tm低25度左右。此外，如果将DNA高温变性后，立刻放在冰上降温，DNA会保持变性的单链状态，(称为淬火，quelling）。同DNA变性一样，影响DNA复性的因素包括：DNA浓度、复性的时间、DNA序列的复杂度等。鉴于DNA的复性的时间与DNA复杂度有关，因此可以通过用C0t值来描述DNA序列的复杂度。序列复杂度低，重复序列多，复性就快，C0t值低；复杂度高，复性慢，C0t就高。 DNA的变性和复性是许多实验的基础，比如PCR和分子杂交实验。例如我们在PCR中遇到高GC含量的模板时，DNA变性可能不完全，会利用一些添加剂来降低Tm值，提高PCR效率。这次课的作业就是与此有关。 另外就是经典的分子杂交实验。分子杂交：指两条单链核酸分子间复性变为为双链的过程。分子杂交技术，利用DNA变性、复性来检测核酸的技术。分子杂交可以发生在DNA单链之间，也可以是DNA单链和RNA之间，或者RNA之间都可以进行分子杂交。2）复性的两个DNA或RNA单链之间，序列可以不完全一致。比如DNA引物与模板之间有一个错配，实际上也能结合为部分双链（如DNA二级结构中的R型环突，R-loop）。3). DNA大小 。 核酸的大小主要用碱基对（base pair，bp）来表示。常用的单位有Kb (kilo base pairs)，Mb (mega base pairs)，Gb (giga base pairs) 等。在这部分中，需要了解C-值悖论。不同生物，基因组DNA的大小差异非常大，从只有几千bp的病毒到十亿以上碱基对的植物、动物。一般将单倍体基因组总DNA的含量可作为一个物种的特征，称为C值。按照常理推断，DNA的碱基多，携带的信息就多，基因的数目就多，能够完成的生命活动也会更复杂。在低等生物中的确存在这样的规律，一个物种的DNA多，往往编码的基因就多，能够适应更复杂的自然环境。但在真核生物中，DNA含量的和它编码基因的数目是没有严格的关联，和生物进化的复杂性也没有严格的对应关系。比如，青蛙的基因组是人的7倍；在植物种，拟南芥基因组只有100多Mb，水稻是400Mb左右，玉米和小麦是Gb以上，但这几种植物的复杂性、进化的程度，其实是等同的。这就引出了C值悖论（C-value paradox），即一个物种的C-值与它的进化没有严格的对应关系。 要完整的回答C-value paradox，可能等大家学完基因组学以及后面的课程，才能系统地解释出现C-值悖论地原因。简单的说，C-值大地物种中可能有大量的非编码DNA，还有就是大量的重复序列（如转座子），因此C值虽大，但并没有包含更多地基因（或是编码更多的蛋白）。那是不是这些非编码DNA和重复区域就是不需要的，是基因组上的“垃圾DNA”，这个问题不容易回答。我们在研究中确实发现有些DNA区域，或者一些有些不表达的重复基因，去掉以后对植物没什么影响。但大家回忆一下第一次课的小幽默。遗传学家将“安全带”去掉，正常情况对汽车的行驶不会由任何影响，只有在撞车时才会发现它是必要的。我们现在将某个基因或某段DNA去掉，并不能完全确定对植物没有影响，也许是在特定条件下才会出现；当然，有一些DNA的确就是“进化”的遗迹，是可以抛弃的。 DNA的一级结构是指各个核苷酸结构单元或碱基的排列顺序，存储了生物的遗传信息。此部分的重点是学习DNA测序的原理。1）Sanger测序最经典的是Sanger测序，也称链终止测序（chain termination method）。它利用DNA合成反应过程中，双脱氧核苷酸的加入使DNA链的合成终止，将终止的DNA链电泳后，来读取DNA序列。我们一般使用的是自动化sanger测序仪，用四种不同的荧光分子，分别标记ddATP、ddCTP，ddTTP和ddGTP。测序反应后，利用激光扫描仪直接读取荧光分子的颜色，获得碱基信息。（视频： https://v.youku.com/v_show/id_XMjk5ODA3ODc2MA==.html?spm=a2h0k.11417342.soresults.dtitle）2). 二代测序方法即使自动化的Sanger测序，在前期需要大量的准备工作，并且测序通量有限，一次电泳也只能进行384个片段的测序反应。2005 年 Roche 公司发布的 454 测序系统标志着测序技术跨人高通量并行测序的时代。第二代 DNA 测序（next generation sequencing，NGS）技术又称大量并行测序技术(massive parallel sequencing,MPS)、高通量测序技术(high—throughputsequencing,HTS)。 NGS其特点是一个反应能同时测定成千上万的DNA片段的序列，但读取序列的长度有限。最早只能读取几十个碱基对长度的小片段，到现在能够并行读取300-500bp的DNA片段的序列 。对于不同的测序技术，需要同学可以去查阅资料，到各个测序公司的官网了解这些测序方法的原理和性能。这里这是点到为止。焦磷酸测序（pyrosequencing）,  454测序仪 。 加入某一核苷酸时，检测DNA合成时是否产生PPi（焦磷酸）来判断碱基序列。 Illumina/Solexa测序：荧光标记和分子阵列。即在一张芯片上同时进行大量的类似Sanger的测序反应。由于使用的末端终止世纪时可逆的，在完成一个碱基的读取后，可持续进行DNA链的延伸和测序。 Ion Torrent测序（半导体测序）：利用半导体芯片捕获DNA合成过程中产生pH值的变化。3). 三代测序即单分子测序技术，在测序过程中不需要涉及PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。三代测序技术具有超长读长，还拥有不需要模板扩增、运行时间较短、直接检测表观修饰位点、较高的随机测序错误等特点。它弥补了第二代测序读长短、受GC含量影响大等局限性，已在小型基因组从头测序和组装中有较多应用。包括以下几个公司的技术。 Helicos （最早，2012年破产） OxfordNanopore 纳米孔测序（Nanopore） Pacific Biosciences的SMART测序，PacBio测序 DNA的二级结构主要是各种形式的双螺旋，除了最常见的B-型双螺旋，此外还有A-型双螺旋、Z-型双螺旋。B-型双螺旋也就是Watson和Crick提出的DNA结构模型，是生物体内DNA的主要形态。DNA还存在三链螺旋和四链螺旋。由于DNA的特殊性质，DNA可以组装成各种二级结构的纳米材料（DNA Origami）。我们感兴趣是有生物学意义的核酸结构。 在DNA复制， 转录，重组等阶段，双螺旋DNA还能形成多样的二级结构，比如分支型的DNA（在DNA修复中会出现），DNA复制时形成Y性的复制叉等 部分特殊的DNA序列哈能形成三螺旋DNA和四股螺旋DNA。三股螺旋DNA 四螺旋DNA ，也称G-quadruplex，在GGG重复序列组成的DNA链中容易形成的四螺旋DNA，发现于端粒、启动子等区域。近年研究发现G-quadruplex可能具有非常广泛的生物学功能，参与转录、翻译等环节的调控。         在细菌、病毒、真核细胞线粒体、叶绿体中，DNA多呈现双链环状分子，是没有自由末端的闭合双链结构（covalently closed circle DNA， cccDNA）。DNA分子可以在双螺旋的基础上，进一步绕同一中心轴扭转，造成额外的螺旋。形成超螺旋的结构。超螺旋本身具有方向性，因此当旋转方向不同时，可产生正超螺旋和负超螺旋两种形式的拓扑结构。右手超螺旋（顺时针），称为负超螺旋（与DNA双螺旋的旋转方向相反的扭转）；反之形成的左手超螺旋（逆时针）称为正超螺旋（与DNA双螺旋的旋转方向相同的扭转）。在生物体内，DNA主要以负超螺旋的形式存在，并通过拓扑异构酶来调整DNA的超螺旋结构。DNA超螺旋与DNA复制和转录都有关（可见DNA复制部分）。 真核生物染色体虽然是线性分子，但其DNA与蛋白质相互结合，以许多大环的形式存在，许多个环的基部聚合在一起形成类似环的结构。此外，真核生物DNA在细胞中高度压缩成染色体结构，在后面的章节中会介绍。3.5 RNA的二级结构RNA为单链，非常容易分子内或是分子间形成双链，进而形成各类二级结构。RNA的二级结构跟它的功能有密切联系，比如核糖体RNA、snoRNA、tRNA的二级结构，siRNA来源于双链RNA，miRNA来源于同一个RNA分子形成的stem-loop结构等。这节的另外一部分内容就是希望大家熟悉各类RNA相关的名词。

---