2021-09-19二代测序技术-1

第二代测序技术又称为下一代测序（NGS），与第一代相比主要是1.高通量测序2.边合成边测序。

回顾二代测序的发展史

1996年Ronaghi和Uhlen发明了焦磷酸测序，454 Life sciences 公司基于此原理推出了测序系统Genome Sequencer 20System，标志着二代测序的商用；

2006和07年 Solexa和ABI公司推出了GA SOLID测序平台

2010年Life Technologies 推出Ion PGM系统

2014年华大推出了BGISEQ-1000

1.Illumina/Solexa测序平台

之前也总结过Illumina测序的原理，现简要梗概一下其步骤

1）DNA文库准备：先将DNA链打断成200-500bp的片段，末端修复后在两端连上特异性的接头

2）流动槽杂交：

带有接头的DNA片段流过流通池，与其上固定的种接头通过互补配对结合。这些固定的接头其后充当引物的作用，在聚合酶的作用下进行合成反应。

3）DNA合成后，变性使得未与流动池共价连接的DNA链解离并洗掉，反向练则以共价键结合在流动池的表面。因为DNA单链另一端也含有接头，能够和临近的接头互补，DNA链形成桥式结构，同样的这个相邻的接头充当引物，在DNA聚合酶的作用下， 合成双链桥式结构。重复此过程，形成5000-10000个copy。这个目的是形成序列相同的DNA簇，使得在测序的过程中产生足够强的信号。变性打开，各自形成单链的DNA链固定在表面。将反向链切除，将正向链的的3‘封闭，以免产生不必要的DNA延伸。

4）DNA测序：加入测序引物，DNA聚合酶，4种带不同荧光标记的dNTP，且这些dNTPde3’端羟基被封闭，无法继续下一个反应。计算机检测到荧光的信号后，将不同的信号转化为对应的碱基。加入化学试剂淬灭信号，并去除3’的保护基团，并进行下一个碱基的反应。

illumina测序一般能够检测150个碱基左右，因为在后续，由于DNA合成酶活力下降等原因，造成相同序列的DNA信号不一致，DNA测序的准确性下降。

在实际的测序过程中，通常一次性会测不同物种来源的DNA，此时，需要barcode来进行标记。不同的物种带有不同的barcode序列，在DNA测序完成后，需要加入barcode引物，将barcode也进行测序。

该测序系统基半导体测序原理，不需要进行光学感应。

原理简要概括如下：

在测序的过程中，识别不同的碱基不是依靠荧光信号，而是通过dNTP结合释放的H+。

更多的信息详见 7种测序平台 - Thinkando - 博客园 (cnblogs.com)

补充：

罗氏454测序

罗氏454的焦磷酸测序是最早发行的二代测序。其测序的文库的建立和Ion Torrent相似，一个磁珠吸附一个模板DNA，充当一个微型的反应器。外面裹以油，将不同的液滴隔离开来。不同的片段平行扩增，待反应结束后，破坏乳液，只剩下磁珠。此时一个磁珠=一条读长。

将磁珠放在PTP板中测序，依次加入ATCG四种碱基。让碱基能够成功配对时，会释放一个焦磷酸。

双脱氧法的核心技术就是在DNA聚合酶合成DNA链的过程中按一定比例掺入双脱氧核苷酸（ddNTP)，导致DNA链在掺入ddNTP时终止延伸。理论上所有的位点均有可能掺入双脱氧核苷，从而产生终止于任何一个位点的寡核苷酸片段，每个片段的3’末端都是一个双脱氧的核苷酸残基，因为四种ddNTP上各有一种发光基团，在最后的识别中通过收集到的荧光信号就能够确定末端的ddNTP。

上机测序：先在毛细管中注入丙烯酰胺溶液，丙烯酰胺在紫外线的电离作用下发生聚合反应变成聚丙烯酰胺凝胶，将DNA片段混合物加入到有聚丙烯酰胺凝胶的一端，在毛细管的两端加上电压进行电泳，在毛细管的正极的末端用激光照射，经过光学传感器记录荧光信号。

BigDye试剂中包括四种荧光标记的ddNTP，dNTP，DNA聚合酶，镁离子，PH缓冲液等。

序列分析（Sanger 测序）：

    1、荧光染料在ddNTP上；

    2、体系中含有荧光标记的ddNTP和未标记的dNTP；

    3、不同碱基用不同颜色的荧光进行标记；

    4、获得一系列长度相差为1bp的片段。

SNaPshot:

    1、荧光染料在ddNTP上；

    2、体系中只含有荧光标记的ddNTP；

    3、不同碱基用不同颜色的荧光进行标记；

    4、获得引物延伸1bp的产物片段。

片段分析：

    1、荧光染料结合在引物上；

    2、体系中只含有未标记的dNTP；

    3、片段长度相近的不同目的片段用不同颜色标记其引物；

    4、获得特定的目的片段。

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