wb时连成一条线可能有以下几种原因

wb时连成一条线可能有以下几种原因： 1）上样量过大 这里指的是质量数过大，一般上样在20-100ug之间就可以，楼主可以减半上样量，试试看。 2）一抗孵育时间过长，适当缩短孵育时间，也可以改善。 3）一抗浓度过大 ，抗体如果很好用的话，增大稀释比例试试。 4）曝光时间过长，同样会由此现象。 但是这其中，上样量影响最大，建议楼主其他条件不动，减少上样量试试，可以减少一半。 按照自己具体实验经验调节。 解决方案如下: 1.检查用的胶的浓度和靶标蛋白的分子量是否适合 2.上样量过高，有的人怕蛋白太少，蛋白浓度又低，蛋白加的太多，一般上样量20-25ug即可 3.样品离子浓度高 4.拔完梳子后，加样孔有残留的胶，这样上样量就少了，因此建议，拔梳子后一定要用水把残留的胶冲净，但也要注意，水一定要吸干，否则和残留胶一样会导致同样的结果。 5.拔梳子时不要左右摇动，避免破坏加样孔底部。 6.上样要迅速，否则会引起样品扩散。 7.上样与跑电泳之间的间隔太长,尽量缩短时间间隔。 8.装配三明治结构要迅速。 9.电泳的电压太高，发热导致扩散。 10.降低一抗浓度。 11.可以适当缩短曝光时间。 12.10%APS现配现用,APS长期存放也会引起同样的问题。

我用的是湿转，我跑分子量130的。没有加SDS。用的是PVDF膜，甲醇活化一般只用半分钟到一分钟，就放入去离子水中泡着待用了。转膜时，是恒流300mA，基本就转1.5-2h。一般没问题的呀。我觉得你检查一下你的转膜缓冲液（我一般不重复用），还有就是铺膜有没有气泡。另外实在找不到原因可以适当延长转膜时间，但也不可以太长。其实120KD转两小时足够了。另外，我有时封闭后也会marker看不清楚，影响不大，只要还能辨别marker的条带就ok了。

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