micro RNA二级结构

RNA干扰及其应用进展

孙德惠1,2,才学鹏1,常惠芸1 ,独军政1

(1中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州 730046;2甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070)

摘 要:RNA 干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象RNAi主要发生在核外,RNAi具有 *** 作简便快速等特点RNAi现象自发现至今已逾10年,在此期间,已将研究重点由机理研究转向应用研究文章以RNAi的应用为重点,从RNAi的起源,可能的作用机制,作用特点,研究方法,应用前景及展望等方面进行了综述

关键词:RNA干扰;双链RNA;基因沉默

RNAi是Napoli C D等[1]在试图向紫色矮牵牛花转导色素合成基因,用以增加其花色时发现的结果出乎预料,转基因的植株不仅没有新基因的表达,反而自身的色素合成也减弱了,一些转基因的花出现了全白色或部分白色他们把这种导入的基因未表达和植物本身合成色素基因的失活现象命名为共抑制(cosuppression)之后,Ramano等在向粗糙孢菌�(Neurospora crassa)�中导入合成胡萝卜素的基因时造成失活,他们称为基因静止(quelling)Guo S等[2]发现正义RNA与反义RNA有相同水平的抑制效应,但未能就此现象给出合理的解释Fire A等[3]在研究反义核苷酸时发现在线虫体内,双链RNA( double stranded RNA,dsRNA)能有效地抑制有互补序列的内源性基因,且抑制效果优于单链反义RNA至此,正式提出了双链RNA诱导的RNAi的概念,开启了RNAi研究的序幕

1 RNAi可能的作用机制及特点

11 RNAi的作用机制

虽然RNAi作用的确切机制尚不清楚,但目前普遍认可是Bass假说具体概括为三个阶段

(1)起始阶段在细胞内,双链RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ) Dicer 在ATP的参与下被处理为21个～23个碱基的小RNA,即小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)siRNA是由19个～21个碱基配对形成的双链,并在其3′末端有两个游离未配对的核苷酸研究发现, siRNA 是RNAi 作用发生的重要中间分子,序列与所作用的靶mRNA 的序列具有高度同源性;双链的两端各有2个～3个突出的非配对的3′碱基;两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基这些是细胞赖以区分真正的siRNA和其他双链RNA的结构基础 研究表明,平末端的siRNA 或失去了5′磷酸基团的siRNA 不具有RNAi 的功能[4]

(2)引发阶段siRNA与Argonaute蛋白家族及其他未知因素结合,形成siRNA-核蛋白复合物(siRNA-ribonucleoprotein complex,siRNP)siRNP在ATP及其他未知因素参与下,使双链siRNA解旋形成RNA诱导的沉默复合物(RNA inducing silencing Complex ,RISC)RISC可能以完全单链或两条链解旋但不完全分离的形式存在,继而RISC在dsRNA的介导作用下与互补mRNA结合,并将其降解mRNA被降解在转录后水平,抑制基因表达,因而又称之为转录后基因沉默( posttranscriptional gene silencing,PTGS)

(3)循环放大阶段在siRNA诱导的RNAi过程中,可能还存在siRNA 的循环放大过程,以维持它的RNA诱导功能此过程推测是以siRNA为引物,互补mRNA 为模板,在RNA依赖性RNA合成酶(RNA-dependent RNA Polymerase,RdRP) 的作用下,合成新的双链RNA,再由Dicer作用,产生新的siRNA,完成siRNA 的放大过程,开始新的RNAi循环[5]

关于对RNAi机制中重要酶的作用研究,Zamore P D等[6]发现,21 nt RNA指导mRNA的降解; Scharf W D等[7]发现ATP依赖的RNA解旋酶为Mut6;Grishok A等[8]发现Let-7和lin-4为内源性的RNAi基因(stRNA);Dalmay T等[9]提出RNA依赖的RNA多聚酶就是SDE-1; Bernstein E等[10]证实RNaseш样的核酸酶为Dicer; Elbashir S M等[11]应用外源性21 nt-siRNA能够抑制同源mRNA的表达;Novina C D等[12]证实无论是针对病毒感染细胞所需的CD4受体,还是针对病毒基因组的gag区域,siRNA都可以有效地使病毒与细胞的基因沉默,抑制HIV的感染与复制

12 RNAi的作用特点

(1)"共抑制"性RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默机制,它的启动子相当活跃,外源基因可以转录,但不能正常积累mRNA;RNAi作用不仅使外源基因在转录后水平上失活,同时诱导与其同源的内源基因沉默

(2)高效性试验证明双链RNA干扰mRNA 翻译的效率比单纯反义或正义RNA 的抑制效率提高了几个数量级;RNAi可在低于反义核酸几个数量级的浓度下,使靶基因表达降到很低水平甚至完全"剔除",而产生缺失突变体表型它比基因敲除技术更为便捷,科学家称RNAi技术为靶基因或靶蛋白的"剔降"(knockdown)

(3)高特异性由dsRNA降解成的小干扰RNA,除其正义链3′端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外,其余碱基在序列识别中都是必需的,单个碱基的改变即可使RNAi失效,RNAi能特异性降解mRNA,针对同源基因共有序列的RNAi则可使同源基因全部失活

(4)高穿透性RNAi具有很强的穿透能力,能在不同的细胞间长距离传递和维持,如在含有双链RNA的溶液中,喂食表达双链RNA的细菌等,能向秀丽隐杆线虫导入双链RNA

(5)"遗传性"已在线虫中观察到RNAi效应通过生殖系传递到后代,说明RNAi具有一定的可遗传性

(6)高稳定性细胞中可能存在天然的稳定siRNA的机制此机制可能是siRNA与某种保护性蛋白结合,从而使其具有相对的稳定性,这些双链RNA 不像反义核酸那样需要多种化学修饰来提高其半衰期

(7)双干扰系统哺乳动物中存在有非特异性干扰和特异性干扰两条独立的途径 非特异性干扰反应是由大于30个碱基对的双链RNA介导,导致整个细胞中非特异性蛋白合成抑制,RNA降解;特异性反应由21 bp～25 bp的小干扰RNA介导,可逃避非特异性干扰系统的"监控",只降解与其序列相应的单个基因的mRNA[11]

2 研究方法

在研究过程中,科研人员逐渐摸索总结出了成套的研究方法目前,展开RNAi *** 作主要有两种方法一种为直接将靶向特定基因的大约21个碱基长短siRNA,或45个~50个碱基的发夹结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)转染到细胞,shRNA在细胞中会自动被加工成siRNA,从而引发基因沉默或表达抑制另一种为构建特定的siRNA表达载体,通过质粒在体内表达siRNA而引发基因沉默此法的优点是排除了RNA酶干扰,延长siRNA半衰期更重要的是,该法可以进行稳定表达细胞株的筛选,且随着质粒复制扩散到整个机体,基因抑制效果可传代试验表明,可被化学合成或体外合成的siRNA抑制的基因同样可被表达相同序列的载体表达出的siRNA所抑制

3 RNAi的应用

31 基因功能研究

在神经生物学研究中,科学家们通过siRNA表达质粒对中脑腹侧神经细胞中的多巴胺能相关基因进行了有效抑制,还通过病毒介导的RNAi建立了此类成年小鼠模型,不仅为建立神经系统的功能缺失模型找到了一些有价值的表型标记,对神经系统的基因治疗也有一定借鉴意义;在癌症研究中,通过shRNA表达载体成功抑制成年大鼠脑癌基因,同时对RNAi的远程(穿过血脑屏障)基因沉默方法进行了非常有益的探索;利用细胞凋亡途径,通过RNAi抑制凋亡基因Caspase-8能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率,并发现Caspase 8 siRNA处理对特异性Fas激活剂(Jo2和AdFasL)和野生型腺病毒介导的急性肝功能衰竭都有效,表明这个动物模型能反应人类急性病毒肝炎多分子参与的机制,增强了siRNA用于急性肝炎病人治疗的希望除了对某些关键基因的RNAi研究外,还在哺乳动物细胞中探索了siRNA在基因组水平上的筛选方法他们建立了一个包含8 000多个基因的siRNA表达框文库阵列,通过它来高通量筛选NF-kB信号途径中已知的及Unique基因由此可见,RNA干扰也正作为筛选成百甚至上千基因的工具,发挥着越来越大的作用[13]RNAi为系统地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径通过在一段时间内对一个基因RNA信号的抑制,研究者可以深入研究基因功能,进而描绘支配从细胞形态到信号系统的遗传网络

32 基因治疗及药物筛选探索

由于RNAi是针对转录后阶段的基因沉默,相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除,整个流程设计更简便,且作用迅速,效果明显,为基因治疗开辟了新的途径其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制,控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达尤其针对引起一些对人类健康严重危害的病毒,如2003年在全球多个国家和地区流行的SARS,病原体是单链核酸的新型冠状病毒,寻找药物靶点,设计核酸药物就更为方便目前已经有很多公司在积极开发这方面的药物,如在SARS药物研究中一鸣惊人的美国俄勒冈州的AVI BioPharma生物制药公司等国内也有很多研究机构及生物技术公司投入了这方面的工作如上海生科院成立了SARS防治科研攻关小组,其中生化细胞所和药物所的一些课题组在从RNAi的角度努力此外,北京大学,中南大学,北京动物所等大专院校和研究机构,以及北京金赛狮反义核酸技术开发有限公司等,也开展了RNAi药物的研究与开发

基因治疗方面最引人注目的进展之一是对肝炎病毒的RNAi研究Mccaffrey A P等通过表达shRNA的载体在细胞水平和转染HBV质粒后免疫活性缺失的小鼠肝脏中成功抑制了HBV复制与对照相比,小鼠血清中测得的HBsAg下降了845%,免疫组化对HBcAg的分析结果下降率更超过99%哈佛大学Lieberman研究小组通过注射针对Fas的siRNA,过度激活炎症反应,诱导小鼠肝细胞自身混乱然后给测试小鼠注入 Fas hyperdrive的抗体,发现未进行siRNA处理的对照组小鼠在几天中死于急性肝功能衰竭,而82%的siRNA处理小鼠都存活下来,其中80%~90%的肝细胞结合了siRNA并且,RNAi发挥功能达10 d,3周后才完全衰退由于Fas很少在肝细胞外的其他细胞高水平表达,它对其他器官几乎没有副作用此外,这个小组还和其他研究者积极开展针对HIV的RNAi测试,目前报道他们使用的针对CCR5蛋白的siRNA能阻止HIV进入免疫细胞约3周,在已经感染的细胞中也能阻止感染病毒的复制

然而,尽管取得了不少研究成果,但要真正用于医疗还需时日目前大多数还停留在小鼠测试阶段,siRNA的导入多采用静脉或腹腔注射,尾部注射,细胞移植等,如何对人进行有效的给药,既能确保药效在靶器官靶组织有效释放,还要具有高度安全性等问题都需进一步研究人们期待着RNAi引领的新医学革命的到来

在药物筛选领域,除了线虫这种低等动物的RNAi高通量药筛模式外,Lavery K S等对RNAi在药筛领域的应用前景进行了高度评价,RNAi技术将逐渐成为药物靶点筛选和鉴定的强大工具他对如何在药筛的各个阶段应用RNAi做了具体描述及展望,并指出将这项技术与高通量筛选,体外生物检测和体内疾病模式相结合,将提供大量基因功能方面的有用信息,在药物开发过程的多个阶段促进靶点的有效筛选

33 抗肿瘤治疗

多种癌基因可以作为靶点设计相对应siRNA[14]Brummelkamp T R等[15]用逆转录病毒载体将siRNA 导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因K2RAS (V12)的表达对急性髓性白血病的研究已经取得了较好的结果Scherr M等[16]以引起慢性髓性白血病和bcr2abl阳性急性成淋巴细胞白血病的bcr2abl癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA,并获得了87% 的有效抑制率Wilda M等[17]用siRNA抑制白血病BCR/ABL融合基因表达也取得了成功 因此,基于RNAi 技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大有报道称,一种全新生物工程药品"RNA干扰剂"(非干扰素)业已浮出水面,并有望在3年内上市经过多年的探索,科学家终于发现,在癌细胞和病毒RNA的22对碱基中有1对碱基专门负责复制工作,只要能使这对碱基"休眠",癌细胞或病毒就会自动停止复制这一重要发现为一种全新药物——RNA干扰剂奠定了基础科学家们相信,艾滋病,乙型肝炎,恶性胶质瘤(恶性脑瘤)和胰腺癌等疾病有望成为RNA干扰剂的第一批受益者(2004年经FDA批准已开始RNA干扰剂的临床试验),艾滋病,中枢神经系统退行性病变疾病如多发性硬化症,阿尔茨海默病,帕金森病等将成为第二批受益者

34 抗病毒治疗

由于RNAi 是机体中古老而天然的抗病毒机制,目前国外科技人员利用此特点,已设计出针对HIV gag,tat,rev,nef等基因的siRNA,针对丙型肝炎病毒非结构蛋白5B基因的siRNA,针对脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白和多聚酶基因的siRNA,针对口蹄疫病毒3D片段siRNA等[18],均在试验中取得理想结果陆续有关通过RNAi抑制其他病毒在细胞内复制的报道如呼吸道合胞病毒,人乳头瘤病毒,乙型肝炎病毒,丙型肝炎病毒[19]等,国内也已设计出针对口蹄疫病毒VP1基因的siRNA,针对丙型肝炎病毒5′保守区的siRNA,针对口蹄疫病毒IRES和L串联序列两侧的保守区的siRNA[20],针对SARS冠状病毒的6个siRNA,即RL001,R L002,RL003,RL004,RL005和RL006,均已取得理想结果针对病原的siRNA已经进行到动物实验阶段[21],向病毒病的有效防治迈出了坚实的一步由此可见,利用RNAi技术将使病毒病的有效治疗成为可能

35 转基因研究

在动植物的转基因试验中, 经常发生基因沉默因此, 对转基因沉默机制的探索可以为在转基因研究中避免基因沉默提供对策在转基因植物研究中避免基因沉默可提高试验成功率,且节省时间,而在大型动物转基因研究中避免基因沉默可节约成本,提高产率

36 干细胞研究

在干细胞研究方面,在dsRNA阻断大鼠骨髓源性神经干细胞 Hes5表达的试验中[22],观察外源性短dsRNA在转录后水平mRNA水平降低基因表达的效率,并对其影响因素进行了初步探讨同时基于干细胞可能拥有自己的一套基因组,不同类型的干细胞又拥有各自所特有的基因,这些基因可能是决定干细胞特性的最关键的实质性因素因此,RNAi技术在此领域应用空间广阔

37 研究信号传导的新途径

Biotech认为,联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系,Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果RNAi技术较传统的转染试验简单,快速,重复性好,克服了转染试验中重组蛋白特异性聚集和转染率不高的缺点,因此认为RNAi技术可能成为研究细胞信号传导通路的新途径

38 常见病的治疗

Nature杂志报道了miRNA(Micro RNA)的应用上一个重要发现,成功采用miRNA调节了胰岛素的分泌,这为糖尿病的治疗带来新的希望,也将为糖尿病的新药研究带来新的曙光和思路据Sicence杂志报道,显示应用RNAi技术可有效降低血管内胆固醇含量,对治疗心血管疾病有明显的作用

4 展望

综上所述,RNAi技术在基因功能研究,抗肿瘤治疗,抗病毒治疗,基因应用研究,常见病的治疗等许多方面都是强有力的工具和手段同时做为新兴的生物技术,还有广阔的研究和应用空间期待着科研人员的探索例如,siRNA在病毒持续性感染过程中扮演怎样的角色 siRNA在冬眠动物体内的作用如何 RNAi在雀斑形成中起到怎样的作用 如上述问题得到解决,将进一步依据其机理及特点,有望应用于病毒持续性感染的鉴别诊断及治疗,利用siRNA在冬眠动物体内的作用进行星际航行,以解决能量供应及时间跃迁问题,RNAi应用于祛除雀斑等

尽管在RNAi方面的研究已取得许多突破性进展,尤其是哺乳动物细胞中的研究的报道逐渐增多,但由于RNAi机制尚未完全阐明,仍有许多问题尚未得到彻底解答例如,siRNA 在哺乳动物细胞中抑制mRNA表达是有效的, 但达不到果蝇细胞那样的高抑制率, 可能是因为生物进化水平越高,调控基因表达系统的复杂程度相应的越高,多种抑制机制间相互作用的频率也越高,抑制作用受到的影响因素也就越多另外, 在哺乳动物中,RNAi能否成功地抑制基因表达以及抑制的程度还取决于细胞类型对线虫来说,可以采用注射,浸泡或喂食的方法转入dsRNA,而对哺乳动物来说,寻找高效的方式来转入siRNA以及快速的方式来筛选siRNA仍在进一步探索中RNAi在抗病毒感染中的应用令人鼓舞, 但要取得最终的成功还有很漫长的路要走其中一个关键的原因是siRNA并不能对所有病毒RNA发生作用,有些病毒靶序列可能隐藏在二级结构下, 或者位于高度折叠的区域中, 而有些病毒序列可能与蛋白质形成紧密的复合物, 阻碍了与siRNA 的识别因此,不仅要选合适的靶序列,而且需要反复试验另一个重要的原因是病毒子代的突变率较高, 这使病毒可逃避siRNA 的识别为了克服这个障碍,所选病毒RNA的靶序列必须是高度保守的, 或者设计数对siRNA同时作用[23]

总之,RNAi作为一种新发展起来的分子生物学技术,不可避免地会存在潜在的问题,这就要求研究者在利用该技术时要考虑到生物安全性等诸多问题,以使RNAi技术更好地为人类服务

参考文献(略)

miRNA的机制一般是作用于靶基因转录mRNA后的3‘UTR段，使得mRNA被分解，无法翻译成蛋白质，因此它们对靶基因都是抑制作用的。

由于每个靶基因都可以由多个miRNA调控，一个miRNA也可能调控多个靶基因，所以你首先得确定你要研究的是哪个靶基因或者哪个miRNA，然后再在数据库中寻找其对应miRNA或者靶基因，再设计实验去证明两者之间的联系。既然你选择的是抗肿瘤作用，那你应该选择原癌基因或者作用于原癌基因的miRNA。

细胞生物学层面，你可以用质粒将miRNA导入选定的细胞系，造成细胞内的某种miRNA高表达，再检测你查找到的对应靶基因的蛋白产物，如实验组比对照组低则有效。

流行病学层面，你需要检测肿瘤组织标本中的miRNA及其靶基因蛋白产物含量，再与对照的正常组织比较。

这只是一个大致的思路，具体实验设计步骤还要靠你自己，中间有很多细节问题没法讲清楚，只要自己去摸索解决，能做到哪一步就看你的能力了。

肿瘤基因组图谱 (TCGA) 计划由美国 National Cancer Institute(NCI) 和 National Human Genome Research Institute（NHGRI）于 2006 年联合启动的项目，目前共计研究 36 种癌症类型。

TCGA 利用大规模测序为主的基因组分析技术，通过广泛的合作，理解癌症的分子机制。提高人们对癌症发病分子基础的科学认识及提高我们诊断、治疗和预防癌症的能力。 最终完成一套完整的与所有癌症基因组改变相关的「图谱」。

TCGA临床数据有两种：

数据文件有 (HTSeq count/ FPKM/ FPKM-UQ)3种

介绍链接

生成raw read counts数据记录==在mirnasquantificationtxt==文件中。多比对用cross-mapped列标注。文件中包括associates miRNA IDs with read count and a normalized count in reads-per-million-miRNA-mapped。

RPM counts记录在 ==isoforms==quantificationtxt文件中。文件中包括miRNA表达量定量分析中的所有列，除此之外还增加了isoforms的基因组坐标信息以及miRNA信息（前体或成熟&accession）

使用Affymetrix SNP 60芯片，基于TCGA level 2 数据，最终生成txt文件，包含5列（片段名称，染色体，基因组位置，结合到芯片上的探针数量，seqment_mean)

包括以下几个平台：

文件包括以下这些列：

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