在数据检索中，当检出文献数量较“多”时，分析其可能原因以及采取何种应对措施

原因：

1、分类检索、刊名导航、初级检索、高级检索、专业检索应用这五种就可以增大信息的检出量，数据库提供15个索引字段，检索时在选择字段的下拉列表框中选取要检索的字段。

2、在高级检索中，一次可以选择1-6个检索词进行检索，检索对话框的内容要依次填入，否则将不能检索到，当输入多个检索词时，需要选择逻辑运算符，系统提供的逻辑运算符包括“并且、不包含、或者”。

扩展资料

1、了解该数据库的收录范围、文献类型、语种和重点领域。

2、尽量使检索式简单，一般先检索最基本的概念，然后对基本概念进行限制，逐渐缩小检索范围，直到检到满意的文献为止。要避免使用一些范围较宽的词和较长的短语等。

3、避免使用of、the、or、from等这些无实际意义的词;注意截词符的使用。

4、如果用一个主题词检索不到文献，试用副主题词或数据库主题词表中的其它相关词检索。

5、做完检索，不管检索式是长是短，都要按下“清除”(clear)键清除检索式，然后才能进行下次检索。

张勇1，苏新1，陈芳2，蒋宏忱1，陆红峰2，周洋2，王媛媛1

张勇（1981－），男，博士研究生，主要从事海洋地质微生物研究。

1中国地质大学地质微生物实验室，北京　100083

2广州海洋地质调查局，广州　510760

摘要：利用分子生物学技术，分析南海北部神狐海域天然气水合物潜力区HS-373PC岩心表层沉积物中古菌多样性，从沉积物中提取总DNA并扩增古菌16S rRNA基因序列，对克隆文库进行系统发育分析。结果显示：所有古菌序列均属于泉古菌（Crenarchaeota）和广古菌（Euryarchaeota）。其中泉古菌以C3为主要类群，另有少量序列属于marine benthic group (MBG)-B,MBG-C、marine crenarchaeotic group I (MGI）、marine hydrothermal vent group (MHVG）和novel group of crenarchaea(NGC）；广古菌以MBG-D为主，其他序列分别属于Unclassified Euryarchaeotic Clusters-1/2 (UEC-1/2）。

关键词：古菌多样性；16S rRNA；海洋沉积物；天然气水合物调查区；神狐海域；南海北部陆坡

Archaea Diversity in Surface Marine Sediments from Shenhu Area,Northern South China Sea

Zhang Yong1,Su Xin1,Chen Fang2,Jiang Hongchen1,Lu Hongfeng2,Zhou Yang2,Wang Yuanyuan1

1Geomicrobiology Laboratory,School of Ocean Sciences,China University of Geosciences,Beijing 100083,China

2Guangzhou Marine Geological Survey,Guangzhou 510760,China

Abstract:Archaeal diversity in the surface sediments from Shenhu Area in South China Sea was studied with the use of 16S rRNA gene phylogenetic analysisAll the retrieved archaeal clone sequences could be grouped into Marine Benthic Group(MBG)-B,-C and-D,Novel Group of Crenarchaea,C3,Marine Hydrothermal Vent Group,Marine Crenarchaeotic Group I,and unclassified euryarhaeotic group,among which MBG-D and C3 were the most predominant groups in the Euryarchaeota and Crenarchaeota,respectivelyThe results indicated that archaea were abundant and diverse in surface sediments from the northern South China Sea

Key words:archaeal diversity; 16S rRNA; marine sediments; gas hydrate exploration area; shenhu area;northern south China Sea

0 引言

海洋生态环境独特，具有高盐、高压、低温、寡营养和光照强度变化大等特点。生活在这一复杂环境中的微生物为适应独特环境条件，在物种类型、代谢类型、功能基因组成和生态功能上形成丰富的多样性[1]，其中原核微生物主要为古菌和细菌两大类群[2]。早期有关古菌存在及多样性的研究仅局限于温度、p H和盐度比较极端与厌氧的环境下，在这些极端环境中发现了超嗜热菌、极端嗜酸菌、极端嗜盐菌和产甲烷菌。目前已经从热泉、热液喷孔、硫质喷孔、盐湖、高碱湖、下水道消化池和瘤胃这些典型的环境中分离出了古菌[2]。随着分子生物学技术的发展，古菌研究的范围逐渐扩大，常见的环境比如海水[3]、盐湖水[4]和土壤[5-6]中，都发现有大量的古菌存在。随着研究领域的扩大，对古菌的分布、新陈代谢的多样性、从极端环境到普通环境的垂向变化以及在生态系统中所起作用的研究显得愈加重要。海洋深部生物圈内的古菌群落已经作为特定地质微生物标志，被用来指示过去和现代海洋的地球化学变化和地质环境的变迁[7]。

南海神狐海域天然气水合物调查研究区位于南海北部陆坡中段神狐暗沙东南海域附近，即西沙海槽与东沙群岛之间海域。根据野外地温梯度测量和室内沉积物样品的热导率测量结果以及钻探站位温度原位测量结果表明，神狐海域研究区的地温梯度为45～677℃/km，其热流和地温梯度处于中—低范围，该区域流体相对活跃，断层发育，有利于天然气水合物的发育[8]。2006年我国在该区实施钻探，已经成功获取了天然气水合物样品[8]。笔者对神狐海域天然气水合物调查区HS-373PC样品岩心表层5～20 cm深度沉积物开展了古菌多样性的调查，并初步探讨它们与沉积物中地质环境的相互作用。

1 材料方法

11 样品采集

2006年夏， “ 海洋四号”调查船在南海北部神狐海域（19°512803 ' N,115°120888 ' E）水深1 402 m处获得重力活塞岩心HS-373PC样品，岩心全长928 cm。本文通信作者随船考察，并采取微生物样。微生物取样间隔为50 cm，取样后在无菌箱中切除表面沉积物，内部样品置于无菌袋保存于液氮中，航次结束后用干冰运至实验室于－20℃保存。实验室 *** 作时，切除表面沉积物以防止污染。

用于微生物计数的样品采集参考国际大洋钻探（ODP:ocean drilling program)201和204航次中所应用的微生物样品处理方法[9-10]，在无菌 *** 作箱中进行：用灭菌手术刀切除岩心外部沉积物，灭菌注射器取约1 cm3样品，加入9 m L高温灭菌并过滤除菌（02 mm）的海水，加入终浓度为4％的甲醛固定，置于4℃保存。航次结束后低温运到实验室4℃保存。

12 微生物计数（acridine orange direct count,AODC）

样品细胞计数参照吖啶橙直接染色计数法[11]改进。样品漩涡震荡10 min，取1 m L加入9 m LPBS(0145 mol/L Na Cl,00045 mol/L KH2PO4,00055 mol/L K2HPO4，灭菌）缓冲液，震荡5min,400r/min离心5 min，静置1 h充分沉淀，取上清液加入1％的吖啶橙5m L，黑暗中染色15 mm，过滤到孔径022μm的聚碳酸酯膜（Whatman,UK）上，用10 m L PBS缓冲液冲洗滤膜，置于载玻片上，于荧光镜下观察计数。

13 DNA提取与16Sr DNA的扩增

称取约1 g样品，使用Ultra Clean soil DNAkit (Mo Bio,Solana Beach,Calif,US）试剂盒提取总DNA，溶于灭菌的纯水中。

古菌扩增引物为：Arch21F(5’－TTC YGG TTGATC CYG CCRGA-3’，Y=A,C or G;R=A or G）和Arch958R(5’－YCC GGC GTT GAM TCCATTT-3’，M=Aor C)[3]。PCR反应条件：95℃变性7min，然后94℃变性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸15min,45个循环，最后72℃延伸10 min。产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收。

14 克隆文库的构建与5序列分析

纯化回收后的PCR产物连接到p GEM-T Easy Vector(Promega,US）上，转化EscherichiacoliJM109感受态细胞。取适量转化后培养的细胞涂到含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB平板上， 37℃培养过夜，12～16 h后取出，置于4℃冰箱。

随机挑选部分白色转化子，接种到上述LB平板上，37℃培养后，使用引物M13-RV (5'－CAG GAA ACA GCT ATG AC-3＇）和M13-47(5'－GTT TTC CCA GTC ACG AC-3＇）做菌落PCR。反应条件如下：95℃变性10min，加入125U Taq酶，然后94℃变性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸2min,35个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，挑选部分样品进行测序。

所得序列用Sequencer 48(Gene Codes Corporation,US）软件进行分析，经Bio Edit软件编辑后，以97％的序列相似性作为划分标准[12]，使用DOTUR软件（>

本研究中所得到的古菌16Sr DNA序列在Gen Bank核酸数据库里的接受序列号为HS373A1－HS373A98(FJ896063-FJ896103); HS373A107-HS373A16(GU181294-GU181316）。

2 结果与分析

21 沉积物微生物计数

表层沉积物中的总微生物计数使用吖啶橙染色直接计数法，计数结果显示微生物的数量约为169×107cells/g沉积物（湿重）。

22 古菌多样性分析

所测序列经筛选后得到132个有效序列，共分为64个OTU。文库覆盖率C=1－(n/N） （其中n为OTU中只出现一个克隆子的数目，N为总序列数）为682％。使用a Rarefact Win软件分析得到克隆文库的饱和曲线（图1）。

图1 南海北部HS-373PC岩心表层沉积物中古菌16SrRNA基因序列饱和曲线

该132个序列均属于未培养类型，同源序列大多数来自海洋沉积物，分别属于泉古菌（Crenarchaeota）和广古菌（Euryarchaeota）两大类（图2）。其中泉古菌以C3[13]为主（占总序列的24％），其他序列属于marine benthic group (MBG)-B[14],MBG-C[15],marine crenarchaeotic group Ⅰ（MGI)[16],marine hydrothermal vent group (MHVG)[17]和novel group ofcrenarchaea(NGC)[15]。广古菌以MBG-D[13]为主（占总序列的16％），其他序列属于unclassified euryarchaeotic clusters (UEC)-1/2。各类群所占比例见图3。

泉古菌中包含92个克隆序列（占总序列的70%）。其中以C3为主要类群，包含32个克隆，同源序列来源广泛，其中大多数来自南海沉积物中，相似性在97％～99％之间。其他同源性最高的序列来自太平洋秘鲁边缘海（ODP Leg 201）和喀斯喀特边缘海（ODP Leg 204）含有水合物的沉积物[13]、墨西哥湾沉积物（AB448792）和维多利亚港沉积物（EF203609）。MBG-B（也称为Deep-Sea Archaeal Group,DSAG)[17-19]类群最先发现于深海沉积物和热液口，该类群广泛存在于多种深海环境中[20]，文库中有2个克隆属于该类群，同源序列来自鄂霍次克海冷泉沉积物[15]、墨西哥湾沉积物（IODP Site 1230）和Juan de Fuca海岭沉积物[15]，相似性为98％～99％，这几个地区沉积物均发现水合物存在。20个克隆属于MBG-C，同源序列（相似性为95％～99％）来自深海沉积物和红树林土壤。12个克隆属于MGI，同源序列源自南海沉积物[16,21]和北冰洋沉积物（FJ571813），相似性在97％～99％之间。有4个克隆属于MHVG，与来自墨西哥湾沉积物的克隆（AB432999）相似性最高（99%）。NGC类群有20个克隆，其中相似性最高（相似性98％）的序列（EU713901）来自鄂霍次克海[15]，其他克隆相似性最高的序列（DQ984855）和（AB433026）分别来自南海沉积物和墨西哥湾深海沉积物，相似性仅为89％和92％。

广古菌包含40个（占总序列的30％）克隆序列。其中MBG-D是优势类群，有21个克隆属于该类群，分为13个OTU。其中大部分克隆同源序列来源于南海[16,21]、智利瓦斯科湖、Skan湾[22]、墨西哥湾、日本南海海槽[23]、鄂霍次克海[15]和秘鲁边缘（ODP Leg 201）有机含量丰富不含水合物的深海沉积物[13]。另2个克隆相似性最高的序列（AF068817）来自大西洋中脊热压喷口[24]，同源性只有86％。19个克隆组成UEC类群，9个克隆属于UEC-1，同源序列来源于南海沉积物、Baby Bare海湾热液喷口[25]和Skan湾[22]。10个克隆属于UEC-2，相似性最高的序列来源于南海[26]和Santa Barbara海盆[27]，相似性在96％～99％之间。

3 讨论

海底沉积物表层有机质含量相对比较丰富，为微生物的生长繁殖提供充足的物质能量。据统计太平洋表层沉积物中微生物（包括细菌和古菌）丰度为108～109cells/cm3沉积物[28]，有活性的微生物丰度为108cells/cm3沉积物[29]。本文HS-373PC岩心表层沉积物使用吖啶橙染色计数获得的微生物的数量，与南海南沙盆底陆坡沉积物中使用荧光原位杂交计数的结果[16]相比数量偏低。

图2 南海北部HS-373PC岩心表层沉积物中古菌16SrRNA基因序列系统发育树

图3 南海北部HS-373PC岩心表层沉积物古菌文库中各类群所占的比例

（其中“Un”为未分类的类别）

HS-373PC岩心的表层沉积物中古菌多样性虽然比较高，但从序列类别来说，大部分所在的类群在其他海区沉积物中都有发现[13,15,17-20,22-24]。尤其是大多数序列与南海其他地区沉积物中所报道的古菌类群[16,21,26]具有很高的相似性。而且在群落组成结构等方面比较起来还是有所不同。

与南海其他地区古菌类群相比，如在西沙海槽表层沉积物中古菌以MGI为主要类群（492%），其他包括TMEG(terrestrial miscel1aneous euryarch-aeotic group）、MBG-A/B/D、C3和NEG(novel euryarchaeotic group）类群以及17％的UEC克隆[21]。南海琼东南沉积物中古菌以MCG和MBG-B(DSAG）为主要类群（各占27％），其他还存在MBG-D、SAGMEG、TMEG和3个克隆的甲烷八叠球菌（Methanosarcinales）以及29％的UEC克隆[26]。MGI类群常发现于海洋和陆地环境，在海洋环境中，广泛分布于表层和次表层沉积物中，该类群可能兼性自养或者代谢类型多样[30]。本文神狐海域水合物潜力区的表层沉积物中的古菌，也有MGI类群出现，该类群所占比例仅为9％。MBG-B类群最先发现于热液口深海沉积物，目前在深海海底沉积物中均发现此类群[20]，该类群在底部甲烷上涌流的上层硫酸盐还原带沉积物中含量丰富，可能在硫酸盐还原和甲烷氧化中起重要作用[31]；此类群在南海琼东南盆地表层沉积物中所占比例较高，在神狐海域表层沉积物中，只有2个克隆出现，测试表明该深度甲烷体积分数较低（约40×10-6），而硫酸根质量浓度较高（2 655 mg/L），说明该深度甲烷氧化与硫酸盐还原程度还比较低。

与上述南海所报道2个地区古菌多样性相比，神狐海域HS-373PC表层沉积物中古菌C3类群的克隆明显占优。该类群尚未有培养种类，具体代谢类型还不清楚。类群中相似性最高的序列来自太平洋秘鲁边缘（ODP Leg 201）和喀斯喀特边缘海（ODP Leg 204）含有水合物的沉积物。

西太平洋日本南海海槽含有天然气水合物的沉积物中，古菌多样性很低，只发现有3种类群的古菌类群，分别与脱硫球菌、热网菌和热球菌相似，没有发现其他类群[32]。东太平洋美国俄勒冈州外海水合物海岭的ODP 204航次1244、1245和1251站位有水合物存在的表层沉积物岩心中，古菌以MBG-B(DSAG）类群为主[13]（约占50％～100%）。而位于东太平洋赤道海域ODP 201航次几个地质环境不同钻探站位的表层沉积物中古菌群落结构不同，其中1230站位（含天然气水合物）古菌以MBG-B(DSAG）类群为主[13];1227站位（不含水合物但有机质含量丰富）古菌以MCG和SAGMEG为主要类群，不含MBG-B(DSAG）类群[13]；而1225站位（不含天然气水合物且有机含量低）古菌以MGI和MBG-A为主要类群，但含少量MBG-B(DSAG）类群[13]。由此可见，即使是在发现了天然气水合物的地区，表层样中古菌的类型和群落结构也随海域或同海域不同站位地质环境而变化。神狐海域HS-373PC表层沉积物古菌的优势类群和上述地区明显不同。前人对南海表层沉积物有机质含量的总结表明，神狐地区属于有机质含量较低的地区[33]。因此，如果就HS-373PC表层沉积物中有机质含量低而古菌群落含少量MBG-B类群这2点来看，和东太平洋赤道海域ODP 201航次1225站位具有一定的相似性。

该岩心采集的区域属于已确定的天然气水合物潜力区，一系列的数据强烈暗示该区沉积物深部存在着天然气水合物[8]。但对该岩心表层沉积物中古菌多样性分析后发现，古菌中没有明显指示天然气水合物存在的类群出现，可能是本文所取的样品处于沉积物表层，各种参数变化不明显，在古菌多样性上没有明显的显示。对于HS-373PC岩心中微生物多样性和地质环境的关系进一步的探讨，还有待于建立在未来获得更多微生物和地质环境分析的基础上。

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理科类大学

一、东京工业大学

东京工业大学，简称东工大，是一所校本部位于东京都目黑区，以工程技术与自然科学研究为主的日本顶尖、世界一流的理工科大学。对于想理工的同学们来讲，这里就是除了东大、京大以外，理工科最值得选择的一所大学了。

◇地点：东京

◇研究科设置：理工学研究科、生命理工学研究科、综合理工学研究科、信息理工学研究科、社会理工学研究科、发明管理研究科。

◇优势研究科：理工学研究科

◇申请建议：教授内诺制，申请难度相对于日本的教授会制度要简单一点，但是不要忘记日本除了东大、京大，就属东工大理工最惹眼了，想进这所大学，对留学生的要求也是比较高的。

二、电气通信大学

电气通信大学，于1918年建立，1949年开设大学教育，以研究电子、通信、计算机、机器人等现代尖端技术学科的国立重点大学，也是在通信方面日本最有特长的专业性大学。大学的简称为电通大或UEC。一直以来是国内计算机、通信专业学生的热门校。

◇地点：东京

◇研究科设置：情报理工学研究科、情报系统学研究科

◇申请建议：教授内诺制，对日语要求不是很苛刻，具备N2的理工科同学可以试试哦。

三、东京农工大学

东京农工大学，与京都工艺纤维大学、信州大学并称为“纤维三大学”。在农学和工学领域内的研究始终处在日本前列。

◇地点：东京

◇研究科设置：工学府、农学府、生物系统应用科学府

◇申请建议：申请门槛相对不高，具备N2以上成绩就可以申请。但是个别老师可能有赴日面试的要求哦。

四、京都工艺纤维大学

京都工艺纤维大学位于京都市左京区。是于1899年建立，简称为工纤或京工纤。与信州大学，东京农工大学一起称为三纤维大学。

◇地点：京都

◇研究科设置：工艺科学研究科

◇优势研究科推荐：工艺科学研究科

◇申请建议：单科类大学，却跻身于日本一流学府。实力不容小觑，教授内诺制，需要N2以上的成绩。

艺术类单科大学

五、东京艺术大学

东京艺术大学位于东京都台东区上野公园的日本国立大学，也是日本唯一一所国立艺术大学!

主要目的为培养美术和音乐领域的艺术家。也多被简称为艺大(げいだい)。东京艺大培养了许多日本代表性的艺术家，其中美术学部是日本绝大多数著名画家·艺术家的摇篮。在日本国内被一致公认为日本最高的艺术家培养机构。

◇地点：东京

◇研究科设置：美术研究科、音乐研究科、映像研究科

◇申请建议：目前来讲，申请难度不低，申请这不仅仅要提供的是较高的语言能力证书，还要提供一定的美术和音乐相关专业的作品。

语言类单科大学

六、东京外国语大学

东京外国语大学是于1897年建立，1949年开设大学教育的日本著名国立大学。是日本仅有两大外国语单科类大学之一。

◇地点：东京

◇研究科设置：世界言语社会专攻、国际日本专攻

◇申请建议：这所大学有选考制度，申请的时候需要注意。

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