如何理解基因富集分析以及富集的意思

1Pathway功能分析及显著性判断对差异表达基因进行Pathway功能分析，并计算Pvalue进行显著性判断，Pvalue越小，表明该pathway变化越显著，并可对每条Pathway通路图进行展示，同时在相应的位置标注差异表达基因。2Pathway中基因相关性分析根据每两个基因共出现在同一pathway中的次数统计，绘制基因共相关点线图，进而得到不同pathway上基因的关联情况。在分析工具上点击“celldifferentiation”，在“TermInformation”中描述了细胞分化术语的基本信息，包括树形及与父结点、子节点关系。对于未知基因名的序列，可以用序列直接检索GO数据库。点击AmiGO首页上方的“BLAST”，进入检索界面。在检索框输入氨基酸或核酸序列或上传序列文件，检索工具能自动识别并相应地选择BLASTP或BLASTX来与数据库中的序列进行比对。以大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ基因polB为例，“HighScoringGeneProducts”栏内显示基因产物的名称、物种信息、p值。

基因间的相互作用又称上位性或基因间互作，考虑两个基因位点A-a和B-b,上位性有四种类型,即纯合基因型间的上位性、A位点纯合基因型和B位点杂合基因型间的上位性（用ad表示）、A位点杂合基因型和B位点纯合基因型间的上位性（用da表示）以及杂合基因型间的上位性（用dd表示）

从代谢系统或基因的调控角度就比较好理解这个问题：任何基因的表达都需要一个表达系统，系统间的因子之间都存在着相互的作用。上游或下游因子的表达与否，剂量都会对当前基因有一定的反馈调控作用。

问题一：怎么判断差异表达的基因 判断差异表达的基因：

不同基因控制合成的蛋白质不同,蛋白质不同表现的生物性状就不同，从而表达出了差异

问题二：怎么判断差异表达的基因 真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的得化、调亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。高等生物大约有30000个不同的基因，但在生物体内任意8细胞中只有10%的基因的以表达，而这些基因的表达按特定的时间和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。其包括新出现的基因的表达与表达量有差异的基因的表达。生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差异表达引起的。

由于基因的差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。研究基因差异表达的主要技术有差别杂交（differential hybridization）、扣除（消减）杂交（subtractive hybridization of cDNA，SHD）、mRNA差异显示（mRNA differential display， DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、代表性差异分析（represential display ysis，RDA）、交互扣除RNA差别显示技术（reciprocal subtraction differential RNA display）、基因表达系列分析（serial ysis of gene expression，SAGE）、电子消减（electronic subtraction）和DNA微列阵分析（DNA microarray）等。

一、差别杂交与扣除杂交

差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differential screening），适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。为了增加这种方法的有效性，后来又发展出了扣除杂交（subtractive hybridization）或扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是通过构建扣除文库（subtractive library）得以实现的。

（一）差别杂交

从本质上讲，差别杂交也是属于核酸杂交的范畴。它特别适用于分离在特定组织中表达的基因、在细胞周期特定阶段表达的基因、受生长因子调节的基因、以及在特定发育阶段表达的或是参与发育调节的基因，同时亦可有效地用来分离经特殊处理而被诱发表达的基因。目前，差别杂交筛选法在克隆基因的分离工作中有着相当广泛的用途。

差别杂交的技术基础十分简单，它不需要任何有关的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是耍拥有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同的mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA类型的总mRNA群体，其二是不含有目的基因mRNA类型的总mRNA群体。因此，可以通过这两种总mRNA（或是它们的cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对由表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点，而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落，供作进一步研究使用。

差别杂交筛选技术已被成功地用于分析爪蟾和粘菌的发育问题。这两个应用例子表明，处于不同发育状态或阶段的>>

问题三：请教关于韦恩图分析差异表达基因的问题 差异表达基因分析是根据表型协变量（分类变量）鉴定组间差异表达，它属于监督性分类的一种。在鉴定差异表达基因以前，一般需要对表达值实施非特异性过滤（在机器学习框架下属于非监督性分类），因为适当的非特异性过滤可以提高差异表达基因的检出率、甚至是功效。R分析差异表达基因的library有很多，但目前运用最广泛的Bioconductor包是limma。

鉴定差异表达基因是表达谱芯片分析pipeline中必须的分析步骤。差异表达基因分析是根据表型协变量（分类变量）鉴定组间差异表达，它属于监督性分类的一种。在鉴定差异表达基因以前，一般需要对表达值实施非特异性过滤（在机器学习框架下属于非监督性分类），因为适当的非特异性过滤可以提高差异表达基因的检出率、甚至是功效。R分析差异表达基因的library有很多，但目前运用最广泛的Bioconductor包是limma。

本专题示例依然来自GEO数据库中检索号为GSE11787 的Affymetrix芯片的数据，数据介绍参阅专题一。

>library(limma)

>design colnames(design) fit contrastmatrix fit fit2 fit2 resultssummary(results)

>vennCounts(results)

>vennDiagram(results)

比较遗憾的是，目前limma自带的venn作图函数不能做超过3维的高维venn图，只能画出3个圆圈的venn图，即只能同时对三个coef进行venn作图。上面的venn图只有一个coef，太简单了。下面是一个由本实验室芯片数据得出的三个coef的venn图例：

>heatDiagram(results,fit2$coef)

红色为control中（与LPS相比）的高表达基因，绿色为control中（与LPS相比）的低表>>

问题四：有做基因差异表达分析的么 有做基因差异表达分析的

利用基因芯片研究干旱胁迫下玉米基因表达

玉米是全球第一大作物、中国第二大作物，而干旱是影响其产量的重要限制因素。山东大学生命科学院张举仁教授的课题组利用基因芯片技术研究了开花期玉米顶叶干旱胁迫下基因的表达。开花期是玉米需水临界期，对干旱胁迫反应最敏感，此时逢干旱会使产量下降幅度最大。张教授的课题组以开花期玉米为材料，分别对其进行短期和长期的干旱胁迫，采用全基因组芯片研究了顶叶中基因的表达情况。分析的结果表明，有197个基因在短期胁迫下差异表达（53%上调），而在长期胁迫下，则有1009个基因差异表达（32%上调）。分离得到的差异表达基因中约有一半的基因功能未知，其他基因按功能则可分为：代谢相关；细胞信号转导；转录相关；蛋白质合成；细胞防御；细胞运输；亚细胞定位等几大类。分析实验表明，在短期胁迫下上调表达的基因中，约有1/3的已知功能基因属于信号转导功能的分类范畴，参与细胞内不同的信号转导途径，这表明信号转导相关基因在玉米对干旱的早期反应中起重要作用。而在长期干旱条件下，顶叶中大量的代谢相关基因差异表达。

吸烟者肺细胞的基因表达模式有助于肺癌的早期诊断

在全世界癌症患者的死亡率中，肺癌的死亡率位居前列。肺癌高死亡率的主要原因之一是缺乏早期诊断工具。研究人员在3月出版的《自然―医学》中报道：吸烟者肺细胞的基因表达模式也许有助于肺癌的早期诊断。

众所周知，吸烟是肺癌的风险因子，因此吸烟者被认为是肺癌的高风险人群。吸烟者的正常上皮细胞的基因表达模型是否可用于肺癌存在状态的一种生物标志呢？AvrumSpira和同事进行了这一研究。在预测患者是否会向癌症发展时，他们研究的生物标志的准确率达到90%。当与其他历史数据结合在一起，准确率可增加到95%。

问题五：怎么判断差异表达的基因 细胞分化就是基因表达差异,同一个体各个细胞内的基因是相同的,但它们的形态结构和功能不同,就是基因选择性表达的结果,造成基因差异

问题六：如何从转录组数据找出差异表达基因 转录本是一个基因序列通过一种剪切后所得的能RNA以前说转录本都是说表达蛋白的现在LncRNA的研究多了,也说是一个转录本了还有没有参考基因组序列的,一般是不可能去GO功能注释的因为去功能注释的时候要有一个背景

问题七：如何分析差异表达基因的ma-plot图 差异表达基因分析是根据表型协变量（分类变量）鉴定组间差异表达，它属于监督性分类的一种。在鉴定差异表达基因以前，一般需要对表达值实施非特异性过滤（在机器学习框架下属于非监督性分类），因为适当的非特异性过滤可以提高差异表达基因的检出率、甚至是功效。R分析差异表达基因的library有很多，但目前运用最广泛的Bioconductor包是limma。

鉴定差异表达基因是表达谱芯片分析pipeline中必须的分析步骤。差异表达基因分析是根据表型协变量（分类变量）鉴定组间差异表达，它属于监督性分类的一种。在鉴定差异表达基因以前，一般需要对表达值实施非特异性过滤（在机器学习框架下属于非监督性分类），因为适当的非特异性过滤可以提高差异表达基因的检出率、甚至是功效。R分析差异表达基因的library有很多，但目前运用最广泛的Bioconductor包是limma。

问题八：求助基因差异表达结果分析 是不是误差造成的，可以做一次重复看一下差异是否真的是不明显。也或许在你说的那个浓度，你所检测的基因表达不敏感，是一个临界浓度？ 我只是推测的。仅供参考。

高等真核生物的基因组一般具有80 000～100 000个基因，而每一个细胞大约只表达其中的15%〔1〕。基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达决定了生命活动的多样性，如发育与分化、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调控等。比较细胞间基因表达的差异为我们揭示生命活动的规律提供了依据。

由于真核细胞 mRNA 3′端一般含有 poly（ a）尾，因此现有的方法基本上都是利用共同引物将不同的 mRNA反转录成 cDNA，以 cDNA为对象研究基因表达的差异。1992年 Liang等〔2〕建立了一种差异显示反转录 pCR法（ differential display reverse transcription PCR， dDRT-PCR），为检测成批基因表达的差异开辟了新天地。迄今为止已出现了大量应用该技术的研究报道〔3，4〕。然而，尽管应用 dDRT-PCR方法已经取得了不少成果，而且该方法还在不断改进之中，但它仍然存在几个难以解决的问题：(1)重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重复〔5〕；(2)假阳性率可以高达90%〔6〕；(3)获得的差异表达序列极少包含编码信息。近年来，针对 dDRT-PCR方法的不足，又有几种新的检测差异表达基因的方法出现，现仅就这方面的进展做一简要介绍。

1基因表达指纹（ gene expression fingerprinting， gEF）： gEF技术使用生物素标记的引物 bio-T13合成 cDNA第一链，用 dGTP对其进行末端加尾，再以富含 c的引物引发合成 cDNA第二链。用限制性内切酶消化双链 cDNA，以交联有抗生物素蛋白的微球捕获 cDNA3′端，以 t4DNA连接酶连接同前述内切酶相对应的适配子，并以 bio-T13及适配子中的序列作为新的引物进行特异的 pCR扩增，得到大量的特异 cDNA片段。适配子末端被32P-dATP标记后，固定于微球上的 cDNA片段经过一系列酶切，产生的酶切片段从微球表面释放出来，其中那些含有标记末端的片段经凝胶电泳后构成 mRNA指纹图谱。通过分析不同细胞间的指纹图谱就能得到差异表达的序列〔7〕。 gEF技术所需的工作量较 dDRT-PCR明显减少，由于用酶切反应替代了条件不严格的 pCR反应，其重复性也较好，假阳性率低，并且所获得的片段中包含有一定的编码信息。 gEF技术最大的缺点在于电泳技术的局限。由于它的指纹图谱要显示在同一块电泳胶上，经过几轮酶切之后常会得到1 000～2 000条电泳带，而现有的 pAGE电泳很少能分辨超过400条带，故只有15%～30%的 mRNA能够被辨认出来，因此得到的只能是高表达基因。如果希望寻找部分新基因，这是一种比较简单有效的方法；如果希望得到有关某种细胞的基因表达谱，可能比较困难；采用双向电泳技术可能会有所帮助〔8〕。

2．基因表达系统分析（ serial analysis of gene expression， sAGE）： sAGE法的建立基于两条理论。首先，一段来自某个转录子确定位置的核苷酸，其长度只要有9～10个 bp，就能够特异地确认该转录子。第二，对短片段标签的链接有利于在同一克隆中对多个标签测序。 sAGE也是用生物素标记的 bio-Oligo(dT)为引物合成双链 cDNA，然后以限制酶（锚定酶）进行酶切，捕获 cDNA3′端。在此处产物被分为两部分，分别与包含有 iIS型内切酶（标签酶）位点的 a、 b连接子相接。 iIS型内切酶的特点是作用位点处于识别位点之外。这样经过酶切，就有可能得到只有9～10bp的标签序列。每两个标签的钝端结合后成为 pCR的模板，以基于 a、 b连接子的引物进行 pCR反应的结果是得到了大量每条包含两个不同来源标签的序列，接下来再用锚定酶酶切、连接，就能将多个不同的标签链接在一起（大约为每条包含数十个不同来源的标签），克隆至质粒载体中后集中测序〔9，10〕。 sAGE的最终结果是通过计算机统计得到的，根据某个标签出现频率的高低来判断并计算其所属基因表达的丰度。对于在数据库中找不到对应序列的标签，还可以利用13bp的寡核苷酸探针（9bp加上锚定酶识别位点的4bp）对 cDNA文库进行筛选，以寻找新基因。 sAGE可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异，精确到每个细胞中大约有多少拷贝，可以建立较全面的基因表达谱，系统地分析基因表达的差异。它的缺点在于工作量非常大，有大量的测序及计算机分析任务；而且，对于寻找新基因而言，仅用长度为13bp的寡核苷酸探针筛选 cDNA文库是很不严格的，根据我们的经验，往往是假阳性结果居多。

3 cDNA3′端限制酶切片段显示（ display of 3′ end restriction fragments of cDNAs）:cDNA3′端 rFD利用带有“踵”结构的锚定 oligo(dT)引物合成 cDNA第一链，以 okayama和 berg的置换法合成 cDNA第二链，然后将双链 cDNA以限制酶消化。本方法的适配子由 a1和 a2两条寡核苷酸构成，其序列与所用限制酶识别位点相符合，先将 a2的5′端磷酸化，再加入 a1退火，就会形成一个 y型结构；把 y型适配子与酶切后的 cDNA片段相连接，以适配子及锚定引物中所含序列为特异引物进行 pCR反应，则只有 cDNA3′末端的一段被扩增出来，这时的产物可用凝胶电泳表示出来构成差异表达图谱。对于每次切割6bp的限制酶来说，每种大概只能切割8%的 cDNA，因此至少需要12种以上的限制酶才能使所有 cDNA都显示出来〔11〕。 cDNA3′端 rFD与 gEF的思路比较相似，由于它利用多种限制酶进行酶切，因此不会象 gEF因凝胶电泳分辨率不够而漏掉信息。它的重复性较好，假阳性率低，尤其是对于已知基因，可以根据选择内切酶的作用位点确定该基因在凝胶电泳中的位置并判断其含量，从而避免了进一步的分析。对于精力有限的研究人员，这可能是个值得一试的方法。 cDNA3′端 rFD方法也存在一些和 dDRT-PCR相类似的缺点，它得到的片段中包含的编码信息比较少，需要多花一些时间对所得到的差异条带进一步分析。

4分子指数的 rNA指纹（ rNA fingerprinting by molecular indexing， mI）:MI是一种能够较好地显示 mRNA中编码序列的方法。它利用Ⅱ s型内切酶的作用位点在识别位点之外可以形成一个4bp的突出端的特点，设计43共64种（最外侧一个核苷酸随机）适配子，使得获取编码序列片段成为可能。首先是以常规方法合成双链 cDNA，用Ⅱ类限制酶进行酶切后连接5′端磷酸化的相应适配子，再以Ⅱ s类

一个良好的开端就是分析感兴趣基因的突变和其它异常，ICGC数据门户提供了几条研究路线。输入一个基因名称，NCBI登录号，或者Ensembl基因ID，点击基因报告（Gene Report），就能在突变摘要（Mutation Summary）中找到已发现的突变和拷贝数变化，以及迄今为止，这些突变在肿瘤中出现的频率。COSMICsection就在体细胞突变列表下方，包括了点突变，少量缺失，以及插入突变等方面的数据。

今天给大家分享一个可以查找正常组织的基因表达谱数据的数据库，这个数据库叫做RNA-Seq Atlas，网址为：>

因为GEO是基因表达综合数据库，RNA是实现遗传信息在蛋白质中的表达。

从GEO数据库获取GSE79973数据集，该数据集包含胃癌疾病与正常样本的表达谱数据，筛选出其中差异表达的lncRNA。

下载GSE62254和GSE15459数据集以及对应的临床数据，通过GSE62254数据集来构建一个临床预测模型，识别出与预后显著相关的lncRNA，通过GSE15459数据集对模型进行验证。

进一步的通过多因素分析来研究ACJJ分期、性别、年龄和样本的风险分数与临床预后的关系。最后通过ssGSEA来发现样本的高低风险组之间通路富集的差异情况。

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