samtools常用命令

1. view

Usage: samtools view [options] <in.bam>|<in.sam>[region1 [...]]

默认情况下不加 region，则是输出所有的 region.

2 sort

sort对bam文件进行排序。

Usage: samtools sort [-n] [-m <maxMem>] <in.bam><out.prefix> 

-m 参数默认下是 500,000,000 即500M（不支持K，M，G等缩写）。对于处理大数据时，如果内存够用，则设置大点的值，以节约时间。

-n 设定排序方式按short reads的ID排序。默认下是按序列在fasta文件中的顺序（即header）和序列从左往右的位点排序。

例子：

$ samtools sort abc.bam abc.sort    ###注意 abc.sort 是输出文件的前缀，实际输出是 abc.sort.bam

$ samtools view abc.sort.bam | less -S

3 index

必须对bam文件进行默认情况下的排序后，才能进行index。否则会报错。

建立索引后将肢唯产生后缀为.bai的文件，用于快速的随机处理。很多情况下需要有bai文件的存在，特别是显示序列比对情况下。比如samtool的tview命令就需要；gbrowse2显示reads的比对图形的时候也需要。

Usage: samtools index <in.bam>[out.index]

例子：

以下两种命令结果一样

$ samtools index abc.sort.bam

$ samtools index abc.sort.bam abc.sort.bam.bai

4  tview

tview能直观的显示出reads比对基因组的情况，和基因组浏览器有点类似。

Usage: samtools tview <aln.bam>山衡 [ref.fasta]

当给出参考基因组的时候，会在第一排显示参考基因组的序列，否则，第一排全用N表示。

按下 g ，则提示输入要到达基因组的某一个位点。例子“scaffold_10:1000"表示到达第

10号scaffold的第1000个碱基位点处。

使用H(左）J（上）K（下）L（右）移动显示界面。大写字母移动快，小写字母移动慢。

使用空格建向左快速移动（和 L 类似），使用Backspace键向左快速移动（和 H 类似）。

Ctrl+H 向左移动1kb碱基距离； Ctrl+L 向右移动1kb碱基距离

可以用颜色标注比对质量，碱基质量，核苷酸等。30～40的碱基质量或比对质量使用白色表示；

20～30黄色；10～20绿色；0～10蓝色。

使用点号'.'切换显示碱基和点号；使用r切换显示read name等

还有很多其它的使用说明，具体按 ？ 键来查看。

5 depth

得到每个碱基位点的逗饥做测序深度,并输出到标准输出。

Usage: bam2depth [-r reg] [-q baseQthres] [-Q mapQthres] [-b in.bed] [...]

-r 后面跟染色体号（region）

注意 ：做depth之前必须做samtools index；

示例：

samtools depth in.bam  >  out.depth.txt

注意： in.bam 必须经过了排序。

6  mpileup

samtools还有个非常重要的命令mpileup，以前为pileup。该命令用于生成bcf文件，再使用bcftools进行SNP和Indel的分析。bcftools是samtool中附带的软件，在samtools的安装文件夹中可以找到。

最常用的参数有2： -f 来输入有索引文件的fasta参考序列； -g 输出到bcf格式。用法和最简单的例子如下

Usage: samtools mpileup [-EBug] [-C capQcoef ] [-r reg ] [-f in.fa ] [-l list ] [-M capMapQ ] [-Q minBaseQ ] [-q minMapQ ] in.bam [ in2.bam [ ... ]]$ samtools mpileup -f genome.fasta abc.bam >abc.txt$ samtools mpileup -gSDf genome.fasta abc.bam >abc.bcf$ samtools mpileup -guSDf genome.fasta abc.bam | \          bcftools view -cvNg - >abc.vcf

目录

samtools 和 picard 都有对SAM/BAM文件进行排序的功能，一般都是基于坐标排序（还提供了 -n 选项来设定用reads名进行排序），先是对chromosome/contig进行排序，再在chromosome/contig内部基于start site从小到大排序，对start site排序很好理解，可是对chromosome/contig排序的时候是基于什么标准呢？

基于你提供的 ref.fa 文件中的chromosome/contig的顺序 。当你使用比对工具将fastq文件中的reads比对上参考基因组后会生成SAM文件，SAM文件包含头信息，其中有以 @SQ 开头的头信息记录，reference中有多少条chromosome/contig就会有多少条这样的记录，而且它们的顺序与 ref.fa 是一致的。

当使用samtools或picard对SAM/BAM文件进行排序时，这些工具就会读取头信息，按照头信息指定的顺序来排chromosome/contig。所以进行排序时需要提供包含头信息的SAM/BAM文件。

那么 普通情况下我们的chromosome/contig排序情况是什么样的?

一般情况下在进行SAM文件的排序时，染色体的排序到底是按照哪种规则进行排序的，不是一个很重要的问题，也不会对后续的分析产生影响，但是在执行GATK流程时，GATK对染色体的排序是有要樱陆求的，必须按照从chr1开始到chr22，最后是chrX和chrY这样的顺序，否则会报错

面对这样变态的要求，我们怎么解决？

在构造ref.fa文件时，让它按照从chr1开始到chr22，最后是chrX和chrY这样的顺序进行组织就可以了：

FLAG列在SAM文件的第二列，这是一个很重要的列，包含了很多mapping过程中的有用信息，但很多初学者在学习SAM文件格式的介绍时，遇到FLAG列的说明，常常会一头雾水

what?还二进制，这也太反人类的设计了吧！

不过如果你站在开发者的角度去思考这个问题，就会豁然开朗

在mapping过程中，我们想记录一条read的mapping的信息包括：

这些信息总结起来总共包括以下12项：

而每一项又只有两种情况，是或否，那么我可以用一个12位的二进制数来记录所有的信息，每一位表示某一项的情况，这就是原始FLAG信息的由来，但是二进制数适合给计算机看，不适合人看，需要转换成对应的十进制数，也就有了我们在SAM文件中看到的FLAG值

但是FLAG值所包含信息的解读还是要转换为12位的二进制数

SAM格式文件的第3和第7列，可以用来判断某条reads是否比对成功到了基因组的染色体，左右两条reads是否比对到同一条染色体

有两个方法可以提取未比对成功的测序数据：

对于PE数据，在未比对成功的测序数据可以分成3类：

看完这一部分，是不是有一个感觉： FLAG玩得溜局颂睁，SAM文件可以处理得出神入化

首先，思考一个问题： 对于PE数据，一条测序片段（fragment）有read1和read2两条测序片段，它们俩的名字相同，那么对于这一条测序片段，对它进行mapping之后得到的SAM文件中会出现几条记录呢？

对于我的这个假设可以用以下的方法进行验桐岁证：

上面的测试结果与我们的假设吻合

但是在一次处理三代测序数据（三代测序数据是Single-End）中发现了不同：

在输出中出现了一些不太和谐的结果：有极少部分的QNAME对应2条以上的记录，这意味着存在一条read会有多条比对记录的情况，why？

对这个与预期不完全相符的结果，尝试去寻找里面的原因，其间进行了各种各样的推理、假设、验证，最终在 李恒的github 中找到了答案

这种情况容易在三代测序数据中出现

如果你用的是Single-End的数据，那么差异应该比较小，不会太明显，而在Pair-End上差异可能会比较大，之所以会产生这些差异，原因有两点：

从上面列出的两点差异可以看出，mpileup默认输出的是高质量的覆盖深度，这是有历史原因的：当场mpileup功能被开发出来就是为了与bcftools组合，将samtools mpileup的输出作为bcftools的输入用于下游的snp-calling，当然需要保证数据的质量

当然可以通过设置对应的参数使得它的属于结果与depth的一致，但是不推荐这么做

下面是对同一个样本的paired-end Fastaq文件比对结果（比对使用hisat2），hisat2和samtools分别给出的mapping rate的统计

hisat2：

samtools flagstat：

从上面可以看出，hisat2给出的mapping rate为85.40%，而samtools给出的为86.32%，两个的统计结果不一样，而且samtools的统计会大一些，what？

介四什么鬼？

我们来简单地分析一下：

hisat2中，

samtools中，

计算没问题，那问题出在哪呢？

有没有注意到上面的两个式子中的分子和分母，计算它们的差值：

分子：

分母：

发现了没有，它们的差值正好都等于samtools flagstat的输出结果的第二行：

所以，hisat2和samtools计算mapping rate的公式实际上分别为：

一般来说，我们想得到的是hisat2计算公式所得到的统计结果，hisat2统计结果在比对结束后会以标准错误形式给出，我们可以将标准错误重定向到一个log文件中，但是如果我们忘了保持这个统计结果，怎么办？

最简单的办法就是重新跑一遍hisat2，但是这样太耗费时间和计算资源了，这时我们可以利用samtools flagstat对SAM文件的统计结果，以及它的部分统计值与hisat2计算公式的关系，快速地算出准确的mapping rate：

参考资料：

(1) 【】从零开始完整学习全基因组测序数据分析：第5节 理解并 *** 作BAM文件

(2) 【生信技能树】【直播】我的基因组（十五）:提取未比对的测序数据

(3) BWA's README in github

(4) 【】黄树嘉《样本量重要，还是测序深度重要? 生物信息工程师可以分为多少种类型? |《解螺旋技术交流圈》精华第3期》

(5) 生信媛《HISAT2的比对率计算结果和SAMTools flagstat不同，你想过原因吗？ 》

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