qpcr程序为什么要设定反应体积

因为要确定加热的体积。

qpcr是一个加热的装置，如果不设置反应体积，仪器不知道应该加热多少体系的量。如果加热的体积过少，会导致反应不均匀，加热体积过多会导致蒸发。

由于qpcr技术需要大体积反应系统，存在较多的背景干扰，且无法获得绝对定量结果。随着临床检测要求的提高，qpc技术不能满足临床一些超高灵敏度、高精密度的检测要求，临床上急需新的检测技术。

目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法

SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA 双螺旋 小沟区域的具有绿色 激发波长 的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

一、实验前准备：

实验试剂及耗材：

试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA

试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master

1号管包含：

热启动Taq DNA Polymerase、反应缓冲液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2

仪器及耗材：

罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等

正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】

二、反转录

实验 *** 作时注意：所有RNA相关的 *** 作均需要佩戴手套，防止RNase污染。严格按照试剂盒使用说明进行相关 *** 作。

按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录。

(1)配制NTC对照：（总13ul）

水——10ul

oligo dT引物 ——1ul

随机六聚体引物——2ul

混匀

（2）配制1、2、3、4号管：（总13ul）

总RNA（s1、s2、s3、s4）——1ul

oligo dT引物——1ul

随机六聚体引物——2ul

水——9ul

混匀

【Note：可将总RNA的模板量适当调整至10ng—5ug，mRNA调整至1—100ng。若RNA样品浓度较低，则可加入10ug/ml的MS2 RNA 来稳定模板RNA】

（3）将配好的反应mix在PCR仪中65℃变性10min，可有效减少RNA的二级结构。加热后，迅速置于冰上制冷，放置5min

（4）在反应Templateprimer mix中分别加入以下试剂：

配制总mix（除了RNA模板和引物）

5X反转录酶buffer——24ul（4ulX6管）

dNTP mix ——12ul（2ulX6管）

40U/ul RNase抑制剂——3ul（0.5ulX6管）

20U/ul反转录酶——3ul（0.5ulX6管）

mix总体积——42ul（7ulX6管）

若样品数量多，先配制反应mix再分装到各个反应管，小心吹打混匀，切勿涡旋震荡。混匀后于微型离心机上离心，使样品和离心管落至管底。

将离心管放置PCR仪中，根据使用的引物和目标RNA的长度进行程序设置：

25℃ 10min

55℃ 30min

85℃ 5min

最后置于冰上停止反应。

此反应产物可于2℃—8℃存放1—2h，或在﹣15℃至﹣25℃下存放更长时间。cDNA产物无需进行纯化即可用于后续的PCR反应。20ul的PCR反应体系可取2—5ulcDNA反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有RNase H 活性，可以在cDNA合成之后去除RNA模板，减少其对后续PCR的影响

SYBR Green 反应体系的配制：

使用LightCycler 480 SYBR Green I Master使用进行基础的绝对定量分析。

实验设计：5个标准样品（包含1个空白对照）

                    5个反转录样品（包含1个NTC对照【Negative Template Control缩写】）

由于样本数较多，如下配置：

不含模板的总体系（594ul）—分装为10管（每管55ul）—每管加入各自的模板（6ul）—每个样分装为3个复管（每管20ul）

按照体系配方配制：

2x Master mix （绿色盖）——330ul（10ulX33）

10x Primer mix  —— 66ul（2ulX33）

PCR级别水（无色盖）——198ul（6ulX33 ）

总体积 ——594ul

用移液q轻柔吹打混匀，然后分装为10管，每管55ul。

标准对照组:在各个管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的cDNA，空白对照加入6ul水代替模板，其余加入6ul已经逐级稀释好的标量模板。

反转录样品组:分别加入6ul浓度调整好的模板DNA，包含NTC。

混匀后将每个样按照20ul/孔分装至96孔板中，用封口膜盖好96孔板。将多孔板置于合适的离心机中室温1500g配平离心2min，然后将准备好的96孔板放入罗氏LightCycler 480中

PCR程序设置与运行：

（1）双击打开LightCycler 480 Software release1.5.0SP4中登录，自动进入软件界面。

（2）点击New Experiment

（3）设置反应体积（对于96孔板，反应体积为10ul—100ul）此次设置20ul

（4）在Program中输入反应名称preincubation，预备性设置一个循环，无需进行荧光收集

（5）点击增加按钮，输入amplification，定义扩增循环的次数为445次，选择荧光的收集功能Quantification

（6）设定PCR扩增循环的温度与时间为95℃10s

（7）点击增加按钮，设定退火温度为60℃10s

【6.7两步 Analysis Mode默认None】

（8）设置延伸温度和时间为72℃20s Acquisition Mode选择Single

（9）设置溶解曲线，在program新的一行中输入Melting curve，Acquisition Mode选择Melting Curves 95℃ 5s，新增设置温度，再点击增加按钮，65℃ 1min 以上两步Acquisition Mode默认选择None

（10）点击增加按钮，95℃ Acquisition Mode选择Continuous ，其他设置无需改动

（11）设置保温的过程cooling，1个循环，无需荧光，40℃ 1min

（12）设置完成后，点击右方保存按钮，保存设置的程序

（13）点击start run，开始运行PCR反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。

样品编辑

（1）实验结束，点击Sample editor，进入样本编辑程序

（2）在select Workflow中选择ABs Quant进行绝对定量，根据样本在板中的排布方式进行样本编辑，设置阴性对照、空白对照、标准品等，在SELECT Sample中选择样品孔

（3）在Sample Name中输入被选择样品名称

（4）最后点击make replicates设置复孔

（5）标准品设置时，需填写拷贝数、稀释倍数、初始浓度即可

（6）编辑好样品后，可进行数据分析，如有需要，也可进行组间分析

结果分析

（1）点击左下方的SUM，将显示出所有信息，包括设置的反应程序、实验结果分析等。

（2）点击Analysis，可对已有的数据进行细致的分析

（3）点击Abs Quant/2nd DerivativeMax，d出Create new analysis窗口

（4）在Subset中选择分析样品的区域即可出现分析图，相应样品的扩增曲线

（5）Standard Curve是根据标准品得出的标准曲线，左侧有扩增效率、斜率、截距、线性关系以及错误率 （一般error值越小，说明实验准确率越高，扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好）

（6）在数据表格，可显示样本的Cp值，以及相应的样本浓度值，按复孔进行数据统计，显示Cp平均值、方差，浓度的平均值以及方差

qPCR这项技术，被广泛用于生物学的研究，只有有以下用途：

qPCR作为一种DNA定量手段，一般情况下， 还可以分为 绝对定量 和 相对定量 。

好的， 那么一般情况下， 我见过比较多的qPCR，都是以RNA相对定量为目的的，也是本文讨论的焦点。

qPCR和PCR一看名字就知道很像， q 就是quantitative的意思，quantitative就是定量的意思。。。（为我的废话鼓掌）

其实，说到底，qPCR就是通过荧光染料或者荧光探针来表征PCR产物的量，进而推断出PCR前，样本的初始核酸量。

具体原理是，对于不同的样本和基因，比较到达一定荧光强度所需要的循环数， 如果你的样本中DNA1的量 大于 DNA2的量，那么理论上， DNA1比DNA2需要更少次数的PCR扩增就可以达到某一个阈值.

如果对于详细原理有什么执念的同学可以自行百度，必应，谷歌。。。

在实际实验过程中， 我们的实验没那么简单

一个仿真例子：

那么我们一般这样做，我会有处理和未处理的细胞，我们想比较这两种细胞geneA表达量的差异，我们在提取细胞的RNA并定量后反转成cDNA后，进行qPCR， 获得geneA和某一个内参基因（如GAPDH）的CT值。内参基因GAPDH在这里起到一个矫正的效果来去除不同的样品间 RNA产量 ， RNA质量 以及 逆转录效率 上的差别。

最最最常用的qPCR相对定量的方法是 ΔΔCT 法 （读作：delta delta CT）

公式如下

即 先用内参基因校准，再算样品与对照组间的差异 ，而我们的表达量的差异就可以表征为

虽然大多数qPCR设备都配有很完备的分析软件，

但是 。。。。。

这些软件的图可能不适合直接放文章，或者， 咳咳，很丑,你想自己修改之类的

而他们一般都不太提供最终计算结果，只提供CT值，那么这个就很让人头大了。

于是乎

秉承着 自己动手丰衣足食 一直折腾一直爽 的传统美德，我写了一个小小的工具，方便大家计算最终的相对表达量

该工具基于微软爸爸的EXCEL和VBA，不限样本数量，基因数量及每组实验的平行个数（如果你有三个复孔，其中一个如果CT和其他两个差别很大，你可以删除该孔，有些组3个复孔，有些2个，不影响程序运行）

在同学（zi）的（ji）强（xian）烈（de）要（mei）求（shi）下，我的qPCR数据处理小程序迎来了V2.0版本，主要增加了自动添加误差线的功能。

大家感受一下， 一键出图 的魅力，喜欢的同学记得点赞，转发哦, 获取链接在文末

获得相对表达量值之后呢，你可以使用origin或者graphpad等工具作图，读者可以查看我往期关于origin的文章哦

文章直通车>>> origin科研作图

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