DNA转录时是怎么选定辶吹

具有平末端或5'-突出末端的双链线性DNA可作为体外转录模板。线性化的质粒DNA、PCR产物或cDNA只要含有双链RNA聚合酶启动子且方向正确均可用作转录模板。

不同RNA聚合酶的同源启动子序列：

T7 TAATACGACTCACTATA (+1)GGG

T3 AATTAACCCTCACTAAA (+1)GGG

SP6 ATTTAGGTGACACTATA (+1)GAA

G (+1)是RNA转录的起始位点正义还是反义RNA转录产物的合成依赖于启动子的方向(相对于目标序列)。正义RNA合成要求目标序列置于启动子的下游，而反义RNA的合成则恰好相反。

质粒模板

质量

质粒DNA的质量影响转录产量和合成RNA的完整性。最高纯度的质粒模板可获最大的转录产量。常规实验方法纯化的DNA如果没有RNases、SDS、EDTA、蛋白质、盐类* 和RNA污染即可用作转录的模板。转录用DNA模板A260/280比值应在1.8-2.0之间。GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit (#K0502)可制备高纯度的转录用DNA。

* 当NaCl或KCl的浓度超过150 mM时，T7和SP6 RNA聚合酶的活性~50%被抑制；当NaCl或KCl的浓度超过250 mM时，T3 RNA聚合酶的活性~50%被抑制。

线性化

如需获得特定长度的RNA转录产物，可在插入位点下游选择合适的限制酶(切割产生平末端或5’-突出末端为佳)切割质粒DNA使之线性化。有报道指出3’-突出末端可能会引起错误转录(1)，应尽量避免。3’-突出末端可在转录前经T4 DNA聚合酶(#EP0061)处理平端化。

由于RNA聚合酶具有很高的持续合成能力，环状质粒模板转录产生不同种类长片段RNA转录子的产量比线性质粒模板高。因此质粒彻底线性化对确保有效合成特定长度转录产物非常重要。如果不能彻底酶切，转录前可考虑凝胶回收(如DNA Gel Extraction Kit (#K0513))线性化DNA。线性化后，推荐酚/氯仿抽提纯化DNA模板：

（1）加入1/10体积3M醋酸钠溶液(#R1181)到DNA溶液中。

（2）彻底混匀。

（3）加入等体积酚/氯仿混合物(1:1比例)抽提后再用等体积氯仿抽提两次。收集水相转移至新离心管。

（4）加入2倍体积乙醇沉淀DNA，-20°C静置至少30分钟，离心收集沉淀。

（5）弃上清，加入500 μl 70%冰乙醇漂洗沉淀。

（6）加入20 μl DEPC处理水(#R0601)重悬DNA。

PCR模板

PCR产物可作为体外转录模板。RNA聚合酶启动子要求定位在待转录序列的上游。

常规体外转录

采用以下 *** 作方法可从1 μg DNA模板中制备10 μg RNA转录产物。反应体系可以放大或缩小。如需高产量转录制备多达200 μg的RNA转录子，请选用TranscriptAid™ T7 High Yield Transcription Kit (#K0441)。

解冻冻存的试剂，混匀后短暂离心。

酶蛋白和核苷酸需冰上放置。

反应缓冲液需室温放置。

1 室温配制以下反应体系：

5X 转录缓冲液 10 µl

ATP/GTP/CTP/UTP Mix, 10 mM each10 µl (终浓度2 mM)

线性化模板DNA 1 µg

RiboLock™ RNase Inhibitor 1.25 µl (50 u)

T7 RNA Polymerase（点击黄颜色查看产品详情）

或T3 RNA Polymerase

或SP6 RNA Polymerase 1.5 µl (30 u)

DEPC处理水 (#R0601)至 50 µl

总体积 50 µl

2 37°C孵育2小时。

3 可选：加入2 μl (2 u) DNase I, RNase-free (#EN0521)，混匀后37°C孵育15分钟除去DNA模板。

4 加入2 μl 0.5 M EDTA, pH 8.0 (#R1021)，65°C孵育10分钟终止反应。

备注

无螯合剂存在时，加热会导致RNA的水解

质体稳定性

质粒的稳定性进行了Har. scientists hispanica simvastatin-resistance基因检测Hfx. volcanii。pMDS99粒(图2)被引入Hfx. volcanii DS70细胞和耐药的殖民地长大在盘子里含有4 lg辛伐他汀曼梯·里−”。一个殖民地subcultured成液体培养基和成长为10代在缺乏辛伐他汀、并为单一的殖民地上镀银的固体培养基辛伐他汀(没有)。殖民地被放在盘子里有或没有4 lg辛伐他汀曼梯·里−”。120殖民地检查,104保留了抗辛伐他汀(即平均损失的每一代±3%)。这些耐药的殖民地的成长在液体培养基辛伐他汀(检查)和他们的质粒miniprep隔离和琼脂糖标准粒凝胶电泳图谱。如图所示,都包含pMDS99数量和规模的限制片段在琼脂糖凝胶(数据分离未显示)。

与Hfx. volcanii重组

以决定是否Har. hispanica simvastatinresistance基因重组处于高频率的基因组中Hfx. volcanii(最可能在hmgA位点)、质粒,含有这种基因pMDS95 PstI之间的位置和注意,但无法复制pOK12中,因为它缺乏halophilic halobacteria起源的复制,传入Hfx. volcanii细胞和抵抗选择板殖民地lg辛伐他汀曼梯·里−4”。一个典型的实验的结果显示在表2。在殖民地的抵抗,数量很少。0±3殖民地的转变将每100 % 10 # transformants混合物(DNA),每lg不改变,如果质体

通过消化和线性化预(注意)。这些价值观与那些控制细胞,要么已经没有DNA添加或质粒仅包含了novobiocin-resistance行列式(pMDS20福尔摩斯等,1990)。使用复制了细胞能力与mevinolin-resistance质粒,pMDS99标记(即pWL102),这些生产高计数(“10% transformant殖民地lg−)。

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